双孢蘑菇复合生物保鲜剂的制备及其在贮藏保鲜的应用

商立超，王文亮，弓志青，崔文甲，贾凤娟，赵凤春，王延圣*

（1.山东省农业科学院农产品加工与营养研究所，农业农村部新食品资源加工重点实验室，山东省农产品精深加工技术重点实验室，山东济南 250100）

（2.山东农业大学生命科学学院，山东泰安 271000）

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）又名白色蘑菇、纽扣蘑菇、洋蘑菇，伞菌目，蘑菇科，蘑菇属，是世界上分布范围最广和最受青睐的食用菌之一[1]，可鲜销、罐藏、盐渍。随着科技的不断发展，国内双孢蘑菇工厂化生产逐渐成为主流，菇房能够精确控制温度、湿度和光线等生长条件[2]，从而实现一年四季不间断生产。直至目前，我国双孢蘑菇的产量和产值均居世界第一位，出口量相当大，其中种植最多的省份是福建、山东、河南等，年栽培总面积6.8×108m2，产量4.6×105t（约占全国生产总量75%）。双孢蘑菇味道鲜美，口感极佳，富含维生素和矿物质等营养物质，具有抗癌、降血压、提高人体免疫力等多种保健功能[3]以及高蛋白、低脂肪、低热量的特点[4]，被赋予“植物肉”、“素中之王”的美称。双孢蘑菇表面没有任何保护结构，在采摘过程中极易受到机械损伤，且采后代谢旺盛，均会导致菇体出现褐变、失水、开伞、菌柄过长等问题，不宜贮藏，造成巨大的经济损失。

普遍认为，影响双孢蘑菇保鲜因素有温度、呼吸强度、相对湿度、气体环境和采摘时菇体成熟度等[5]，因此可通过控制以上因素实现贮藏保鲜的目的。目前，双孢蘑菇的保鲜手段有低温贮藏、辐射保鲜、气调保鲜、涂膜保鲜等[6]，但低温和辐射保鲜耗能大，单一气调保鲜效果差，而化学保鲜虽在其他果蔬早已应用，如柑橘等，但安全系数低[7,8]。相对而言，生物涂膜保鲜健康、来源广泛，并且近年来已有研究发现生物源（包括植物源、动物源和微生物源）保鲜剂对某些果蔬采后贮藏保鲜具有良好效果[9,10]，但问题是单一保鲜剂效果不明显，因此基于有效保鲜成分之间的协同作用，将单一保鲜剂复合为可食用涂膜应用于贮藏保鲜，有效保鲜成分之间通过协同作用能够显著提高保鲜效果，俨然已成为如今贮藏保鲜技术的研究热点之一[5]。

本文主要以茶多酚、L-精基酸、L-谷基酸、Vc、大蒜提取液、ε-聚赖氨酸、Nisin、生姜提取液、果胶、黄原胶、卡拉胶和水溶性壳聚糖等12 种常见保鲜剂作为试验材料，通过评比白度、开伞度、质地、发粘度和气味初步筛选出对双孢蘑菇保鲜效果较好的单一保鲜剂，随后将择优筛选出的保鲜剂通过响应面进行复合并优化浓度，研究Vc-Nisin-卡拉胶复合生物保鲜剂对双孢蘑菇的保鲜效果，为寻找安全高效的双孢蘑菇贮藏保鲜剂提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜双孢蘑菇、生姜、大蒜，山东省济南市历城区苏家市场；茶多酚（纯度99%）、ε-聚赖氨酸（纯度95%）、Vc（食品级，纯度99%），上海源叶生物科技有限公司；L-谷氨酸、L-精氨酸、邻苯二酚（纯度均为99%），阿拉丁试剂（上海）有限公司；Nisin（效价1100 IU/mg），浙江新银象生物工程有限公司；卡拉胶、黄原胶、果胶、水溶性壳聚糖（均为食品级），河南万邦实业有限公司；2,2’-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二铵盐）（ABTS）（纯度 98%），上海麦克林生物试剂公司；2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH）（纯度98%），北京酷来搏科技有限公司；浓盐酸、甲醇、乙酸、乙酸钠（均为分析纯），国药集团化学试剂公司；LW-S500B 型无孔包装盒，福建厦门鲜元包装有限公司。

1.2 仪器与设备

NewClassic ME 型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；IN612C 型低温恒温培养箱，重庆雅马拓科技有限公司；CR-400 型色差仪，河北美能达建材科技有限公司；UV-6100 型紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；HH-S6 型数显恒温水浴锅，江苏金怡仪器科技有限公司；SB25-12DTD型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；FSH-2 型可调高速匀浆机，常州市伟嘉仪器制造有限公司；DTY-ZBJ-40 型制冰机，北京德天佑科技公司；TGL-16A 型离心机，湖南平凡科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 保鲜剂配制与样品处理

1.3.1.1 保鲜剂配制

通过查阅和研读有关贮藏保鲜方面的资料，确定了待筛选的保鲜剂类别和浓度，分别为茶多酚（5.00 g/L）、L-谷氨酸（10.00 mmol/L）、L-精氨酸（10.00 mmol/L）、Vc（0.50 g/L）、大蒜提取液（料液比1:5 g/mL）、ε-聚赖氨酸（0.30 g/L）、Nisin（0.40 g/L）、生姜提取液（料液比1:3 g/mL）、果胶（5.00 g/L）、黄原胶（2.00 g/L）、卡拉胶（3.00 g/L）、水溶性壳聚糖（10.00 g/L）。

茶多酚、L-谷氨酸、L-精氨酸、Vc、ε-聚赖氨酸、Nisin 和水溶性壳聚糖保鲜剂的制备：根据浓度，将适量固体试剂与适量无菌蒸馏水混匀溶解即可，低温保存备用。黄原胶保鲜剂的制备：1.00 g 黄原胶粉与500 mL 70 ℃无菌蒸馏水混合，浸泡10 h后搅拌均匀即可。果胶保鲜剂的制备：2.50 g 果胶粉与500 mL 90～95 ℃无菌蒸馏水混合，高速剪切至无结块，然后在95 ℃下保温15 min 至溶胶充分即可。卡拉胶保鲜剂的制备：1.50 g 卡拉胶粉与500 mL 室温无菌蒸馏水混匀，浸泡5 h 后水浴加热，从室温逐渐加热至75 ℃，期间不停搅拌至均匀即可。大蒜提取液、生姜提取液的制备：分别取无病虫害、无机械损伤的大蒜、生姜各100 g，按料液比加入无菌蒸馏水（大蒜500 mL、生姜300 mL），研磨成匀浆，然后将大蒜匀浆和生姜匀浆分别在35 ℃和45 ℃水浴条件下各不断搅拌30 min，最后12000 r/min 离心10 min 取上清即可，低温保存备用。

1.3.1.2 样品处理

试验前，挑选大小一致、无机械损伤和病虫害的新鲜双孢蘑菇，并于4 ℃冷库中预冷6 h，预冷结束后使用无菌刀片切除多余菌柄使其能平稳放置，并将其分组编号；试验时，用单一保鲜剂浸泡30 s，待水分完全蒸发后装入PET 无孔保鲜盒中，一并置于4 ℃低温恒温培养箱中贮藏。以无菌蒸馏水浸泡30 s 为阴性对照（CK）。

1.3.2 择优筛选试验

通过预试验可知，不同处理组之间的差异在贮藏第8 d 最显著，选择贮藏第8 d 的双孢蘑菇为试验样品，通过白度值和感官评价高低对保鲜效果进行评价，择优筛选得到的保鲜剂进行下一步响应面复合优化试验。

白度值测定：使用便携式色差计测定双孢蘑菇伞盖固定3 个位点（正三角形顶点）并记录，随附的标准白板用于校准色差。每个处理3 个重复，每个重复50 个子实体。

感官评价：参考于官楚[11]的感官评价方法并稍作修改，制定了感官指标评价标准表，如表1 所示。由按国家标准招募和培训后的十名优选评价员（男女各5 名）[12]按照国家标准[13]对试验样品进行感官评定并打分。每个处理3 个重复，每个重复50 个子实体。

表1 双孢蘑菇感官指标评价标准Table 1 Evaluation criteria for sensory indexes of Agaricus bisporus

1.3.3 响应面法优化试验

1.3.3.1 单因素考察试验

通过预试验得知不同浓度处理组之间差异在贮藏第8 d 最显著，因此，选择贮藏第8 d 的双孢蘑菇作为评价对象分析Vc、Nisin 和卡拉胶及其水平对子实体白度值和感官评价的影响，单因素试验因素水平设计见表2。每组试验随机选取50 个蘑菇进行测定，重复三次。

表2 单因素试验因素水平设计表Table 2 Factor level design table of single factor test

1.3.3.2 响应面试验

以Vc（A）、Nisin（B）和卡拉胶（C）为响应因素，以白度值为响应值（Y），设计三因素三水平响应面试验。响应面试验因素水平见表3。

表3 响应面试验因素水平Table 3 Factors and levels in response surface design

1.3.3.3 响应面预测及验证试验

以同一品种双孢蘑菇作为试验对象，在与响应面试验相同的试验条件下，依据响应面预测结果即最佳浓度设置试验进行验证，观察贮藏0～8 d 双孢蘑菇白度值的变化情况。以白度值为纵坐标，以贮藏天数为横坐标作图。

白度值测定方法同1.3.2，设置3 组平行，每组处理50 个双孢蘑菇。

1.3.4 贮藏品质测定试验

1.3.4.1 子实体表观指标的测定

失重率测定：采用称重法。重复三次，每次处理固定25 个子实体。其计算方式如下：

硬度测定：利用TA.XT.plus 型质构仪对双孢蘑菇菌盖表面进行测定，选用直径2.00 mm 的圆柱形平端探头（P/2），把双孢蘑菇去掉菇柄使其稳固在质构仪操作台上，测试点为菌盖中心点，选择压缩测试模式，测前速度1.00 mm/s、测中和测后速度2.00 mm/s，下压深度为6.00 mm，接触出发力为5.00 g，力-时间关系曲线图像自动生成，以图像最高峰为硬度指标，每次测定随机选取50 朵蘑菇并取其平均值。

腐烂率测定：定义双孢蘑菇腐烂面积高于50%即为腐烂。其计算方式如下：

每次测定随机选取50 朵蘑菇，重复三次。

1.3.4.2 子实体生理指标的测定

取样：用直径1.00 cm 打孔器在子实体伞盖赤道位置选择等距离三个点，取皮下深度为5.00 mm果肉组织，随后立即用大小均一的锡箔纸包装并液氮冷冻处理，置于-80 ℃冰箱保存备用。以无菌蒸馏水浸泡为阴性对照（CK 组），以不作任何处理为空白对照（BC 组），每次处理50 个子实体。

总酚含量测定：参照范存斐等[14]的方法。

PPO 活性测定：参照YU Kaibo 等[15]的方法。

DPPH 自由基清除率：参照QIAO Jingya 等[16]的方法。

ABTS 阳离子自由基清除率：参照贾仕杰等[17]的方法。

1.4 数据统计与分析

各项指标结果均以平均数±标准误差表示，使用IBM SPSS 25.0 软件对数据进行方差分析，运用Duncan 多重比较法对差异显著性进行比较分析（p＜0.05），使用Microsoft Excel 2019 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 单一保鲜剂择优筛选结果

抗氧化型、抑菌型和成膜型保鲜剂对双孢蘑菇白度值和感官评价的影响见图1。茶多酚处理组白度值和感官评价分值显著下降（p＜0.05），分别为73.77 和17.47 分，低于CK 6.01%和16.89%，表明茶多酚自身颜色会严重降低菇体商品价值；L-谷氨酸和L-精氨酸都属于非必需氨基酸[18,19]，在水果保鲜有所应用[20]，本研究中L-精氨酸在一定程度上可延缓双孢蘑菇褐变，但效果并不突出，白度仅为80.18，而L-谷氨酸处理组白度值78.36 和感官评分22.18，与对照组并无明显差别，表明无保鲜效果；Vc 可清除机体内H2O2和·O2-，保护细胞膜，其作为一种天然保鲜剂，在切花、果实、种子和块根上的保鲜作用己得到证实[21,22]，而通过本研究发现，Vc 处理组的白度值在所有组别中下降幅度最小，贮藏末期为82.13，较贮藏前仅降低9.67%，同时开伞和发黏程度明显降低，质地和气味保持良好，感官评价高达29.51 分，并达到显著水平（p＜0.05），表明Vc 能够有效延缓双孢蘑菇褐变，延缓衰老。综合考虑，选择Vc 作为抗氧化型保鲜材料进行下一步试验。

大蒜、生姜属于香辛料，张强等[23]将其应用到冷却肉保鲜上并证明保鲜效果良好，但本研究发现，大蒜、生姜提取液白度值分别为73.46、75.51，感官评价14.25、17.19 分，对双孢蘑菇不仅无保鲜效果，反而降低了品质，这两组处理的白度值分别低于CK 组6.76%和4.16%并显著（p＜0.05）；ε-聚赖氨酸是由25～30 个赖氨酸残基构成，在人体内降解为必需氨基酸[24]，对冷鲜猪肉有较好保鲜效果[25]，但对双孢蘑菇保鲜效果一般，白度值81.45，仅高出CK 组3.37%；Nisin 是由34 个氨基酸组成的多肽类化合物，稳定性好、食用安全，被广泛应用于果蔬、乳制品、肉制品等食品贮藏保鲜中[26]，Nisin 处理组白度值和感官评价最高，分别为83.42和26.14 分，高于CK 组5.89%和40.00%，说明Nisin能够通过有效抑制微生物活动，减少其对菇体表面的侵害，保持子实体细胞完整性，从而延缓双孢蘑菇腐烂变质及褐变的产生，维持双孢蘑菇白度值和感官品质，保证其商品价值。综合考虑，选择Nisin作为抑菌型保鲜材料进行下一步试验。

多糖类涂膜保鲜是利用其粘附性使得果蔬样品表面带有一层薄膜，从而抑制呼吸作用、保持酚类、类黄酮、抗坏血酸等物质较高含量水平，以及提高抗氧化酶活力[27]，最终延缓果蔬新鲜度下降，延长货架期。已有研究表明，多糖涂膜能够有效保持果实色泽和硬度，延缓营养流失，降低腐烂率，比如樱桃[28]、番茄[29]等。由图1 可知，较CK 组（白度值78.79；感官评价20.42 分）而言，果胶处理组感官评价22.57 分，虽略有提高，但白度值（77.12）却不增反降，表明果胶可能促进褐变的发生；黄原胶和水溶性壳聚糖处理组在感官评价（24.12 分和26.45 分）和白度值两方面都有所提高，但在延缓褐变方面，两组处理白度值分别为79.71 和78.68，较CK 组均不显著，无明显差别；而卡拉胶处理组在贮藏第8 d 的白度值依然高达82.96 并显著（p＜0.05），感官评价28.87 分，分别是CK 组的1.05倍和1.41 倍。因此，综合考虑，选择卡拉胶作为成膜型保鲜材料进行下一步试验。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 Vc 浓度选择

不同浓度Vc 对双孢蘑菇白度值和感官评价的影响见图2。随着Vc 浓度逐渐增大，白度值和感官评价均先缓慢升高后逐渐减小。由图2a 可知，白度值分别为79.35、82.96、83.89、82.57 和74.81。相对于CK 组77.37，0.20～1.10 g/L Vc 均可提高白度值，分别提高2.56%、7.23%、8.43%、6.72%，0.50、0.80、1.10 g/L 达到显著水平（p＜0.05）；由图2b 可知，感官评价23.70、29.20、33.90、33.30和24.00 分。Vc 在0.20～1.10 g/L 浓度范围内可抑制开伞、发黏以及异味的产生。产生此结果的原因为Vc 是能将醌类物质还原成酚类物质的还原剂，还是PPO 分子结构中铜离子的螯合剂，能够降低或抑制PPO 活性，两方面协同保持新鲜度[30]。但是过多Vc 则会因被氧化分解而积累较多的脱氢抗坏血酸（DHAA），DHAA 又会与氨基酸反应促进褐变的发生[31]，本试验结果也证明了这一点，1.40 g/L Vc处理组白度值低于CK 组4.94%。因此考虑选择0.50、0.80、1.10 g/L 作为响应面因素考察水平。

2.2.2 Nisin 浓度选择

不同浓度Nisin 对双孢蘑菇白度值和感官评价的影响见图3。随着Nisin 浓度不断增加，白度值和感官评价菌呈现先增大后降低趋势。由图3a 和图3b 可知，0.10、0.25、0.40、0.55 g/L 处理组白度值分别为78.84、81.88、84.23 和82.17，高于CK 组1.90%、5.83%、8.87%、6.20%，其中0.25～0.55 g/L均显著高于CK 组，并且感官评价分别为20.30、25.90、33.70 和29.00 分，这表明Nisin 可降低双孢蘑菇褐变、开伞和发黏程度、延缓变软进程、抑制异味产生，这是因为Nisin 能改变细菌细胞膜内外渗透压、破坏细胞膜完整性、影响磷脂化合物合成，进而减少微生物的侵害，延长货架期。0.55 和0.70 g/L 处理组虽在控制开伞、保持质地和抑制发黏方面较出色，但因Nisin 本身为淡黄色，颜色会随浓度增大而加深，当双孢蘑菇白度值分别低于80.00和69.00 时，从批发和消费者角度出发，是不被接受的[32,33]。最终Nisin 浓度选择0.25、0.40、0.55 g/L作为响应面因素考察水平。

2.2.3 卡拉胶浓度选择

不同浓度卡拉胶对双孢蘑菇白度值和感官评价的影响见图4。由图4a 可知，所有浓度卡拉胶均能抑制双孢蘑菇白度值下降，分别为82.86、83.78、84.85、83.75 以及83.96；由图4b 可知，感官评价分别为26.20、28.60、34.70、27.90 和20.80 分，依然满足消费者需求[33]。这是由于卡拉胶作为多糖类可食性涂膜成分之一，能够附着在双孢蘑菇表面进而阻滞水分、氧气和溶质的流动，降低生理代谢水平，提高感官属性和新鲜度[34]。与CK 组相比较，1.00～9.00 g/L 卡拉胶处理组均可保持较高的白度值并显著（p＜0.05），但随着浓度增加白度值并没有得到提高，反而会影响感官品质。感官评价中，5.00 g/L处理组效果最好；而7.00 和9.00 g/L 处理组虽在一定程度上保持质地和控制开伞，但浓度过大会导致异味产生以及黏度增加，这是导致它们感官评价低的主要原因，更不易被消费者接受。因此考虑，选取3.00、5.00 和7.00 g/L 作为响应面因素考察水平。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 三因素响应面试验

根据单因素试验结果，采用Box-Behnken 中心组合设计原理，进行三因素三水平RSM 分析试验，分别考察Vc 浓度（A）、Nisin 浓度（B）和卡拉胶浓度（C）对白度值（Y）的影响，结果见表4。

表4 响应面试验设计及结果Table 4 Design of response surface experiment and results

2.3.2 响应面方差分析

采用多元回归拟合上述试验结果，得到以白度值为目标函数、各参数编码值的多元二次方程：Y=86.18-0.06A+0.43B+0.83C-0.16AB-0.96AC+0.09 BC-3.35A2-1.68B2-2.44C2，对其进行显著检验与方差分析，结果见表5。

表5 响应面方差分析Table 5 The variance analysis of response surface experiment

从表5 可知，该回归模型p=0.0004＜0.01，表明二次回归方程模型显著；失拟项p=0.3865＞0.05，表明该回归方程拟合度较高；R2=0.9868，表明模型可充分拟合试验数据，可用来预测复合生物保鲜剂最优配方。通过该模型方差分析可知：在所有作用因素中，一次项 B 对双孢蘑菇白度值影响显著（p＜0.05），一次项C、交互项AC 和二次项A2、B2、C2对双孢蘑菇白度值影响极显著（p＜0.01），一次项A、交互项AB 和BC 对双孢蘑菇白度值影响均不显著（p＞0.05）。F 值大小表示各因素对试验的影响程度，从表5 可知，对双孢蘑菇白度值影响顺序为：卡拉胶（C）＞Nisin（B）＞Vc（A）。

2.3.3 两因素交互影响综合评分响应面分析

不同因素交互影响双孢蘑菇白度值响应面，见图5～图7。等高线形状反映交互效应强弱，其中椭圆形表示两种因素交互作用显著，圆形则表示两种因素交互作用不显著[35]。

Nisin 和Vc 双因素交互作用对双孢蘑菇白度值的影响见图5。由此可知，Nisin 与Vc 交互作用对白度值影响是先上升后下降，整体图像呈弧形。当Nisin 浓度0.40 g/L、Vc 浓度0.80 g/L 时，白度值86.32，等高线接近圆形，表明A、B 两种因素交互作用对双孢蘑菇白度值影响不明显。Nisin 和Vc 过多均会降低商品价值，过少则无明显保鲜效果。

卡拉胶和Vc 双因素交互作用对双孢蘑菇白度值的影响见图6。经分析，卡拉胶与Vc 交互作用所产生的3D 图像呈一个弧面，白度值随两者浓度增加而先升高后降低。当卡拉胶浓度5.00 g/L、Vc 浓度0.80 g/L 时，白度值86.46，等高线为椭圆形，表明A、C 两种因素交互作用对双孢蘑菇白度值影响明显，这是因为卡拉胶可作为基质使Vc 附着在子实体表面，保证Vc 充分发挥抗氧化功能，从而起到稳定持续的缓释保鲜作用。

Nisin 和卡拉胶双因素交互作用对双孢蘑菇白度值的影响见图7。图7 表明Nisin 和卡拉胶两者交互作用所构成的3D 模型图呈弧形。随着两者浓度的增加，白度值先升高后降低。等高线图趋向椭圆形，表明交互作用显著，并且要比卡拉胶和Vc 双因素交互作用更显著。当Nisin 浓度0.40 g/L、卡拉胶浓度5.00 g/L 时，白度值最高。卡拉胶同样作为基质会使Nisin 牢牢地附着在菇体表面，充分发挥缓释效用，抑制大多数微生物生长和繁殖活动，持续保护菇体减轻微生物侵害作用。已有研究证明，以壳聚糖为基质、Nisin 为抑菌成分的涂膜可以抑制PPO 和POD的活性，减缓贮藏过程中机体酚类物质的损失，从而降低褐变程度，延缓白度值的下降[36]。

2.3.4 预测及验证试验结果

依据响应面图和等高线图，清楚表明三因素不同浓度对双孢蘑菇整体白度值产生的影响。通过对二次抛物线函数模型极值分析，得到天然复合生物保鲜剂最佳浓度条件：Vc 0.79 g/L、Nisin 0.42 g/L、卡拉胶5.36 g/L，在此最优浓度条件下，白度值86.28。为进一步验证响应面分析结果的可靠性以及方便实际操作，选择Vc 0.80 g/L、Nisin 0.40 g/L、卡拉胶5.40 g/L 作为最优浓度。

响应面验证试验结果如图8，三组处理白度值在贮藏期0～8 d 内均呈下降趋势，且在整个贮藏期内复合生物保鲜剂组白度值始终高于两组对照，在第4、6 和8 d 达到显著水平（p＜0.05），其中测得第8 d 双孢蘑菇白度值86.10，并且高出BC 组9.00%，CK 组21.32%，与模型预测值接近。因此，采用响应面法优化得到的复合生物保鲜剂浓度准确可靠并具有较好保鲜效果，可进行下一步双孢蘑菇的品质测定试验。

2.4 品质测定试验结果

2.4.1 最优配方对贮藏期双孢蘑菇表观指标的影响

最优配方对贮藏期双孢蘑菇表观指标的影响结果见表6。由表6 可知，失重率、硬度和腐烂率均会随着贮藏时间延长而发生相应变化，这说明采后双孢蘑菇依然进行着旺盛的生理代谢活动。复合生物保鲜剂处理组在贮藏期第2 d 开始至贮藏末期，其失重率（0.98%～4.75%）均显著低于两组对照（p＜0.05）；在硬度保持方面，CK 组硬度下降的最快，BC 组次之，复合生物保鲜剂组在中贮藏末期依然保持312.80 g 硬度水平并显著（p＜0.05）；在腐烂率方面，复合生物保鲜剂处理组在贮藏期第4 d 刚出现腐烂的现象，较对照组推迟2 d，同时在整个贮藏期间，BC 组和CK 组腐烂率均显著高于复合生物保鲜剂处理组（p＜0.05），尤其是第8 d，复合生物保鲜剂处理组仅为4.33%。以上试验结果足以表明复合生物保鲜剂能够降低双孢蘑菇生理代谢水平，对子实体抗逆能力和新鲜度的保持具有积极意义。

表6 最优配方对贮藏期双孢蘑菇失重率、硬度和腐烂率的影响结果Table 6 Effects of optimal formula on weight loss,hardness and decay rate of Agaricus bisporus during storage

2.4.2 最优配方对贮藏期双孢蘑菇生理指标的影响

2.4.2.1 PPO 活力的变化及分析

当植物组织衰老或受损时，PPO 与底物亚细胞区域化被破坏使得PPO 被活化，与酚类物质发生氧化反应生成醌类物质，进一步聚合生成黑褐色或深棕色沉积物，因此PPO 与组织褐变存在直接关系[22]。由图9 不难看出，BC 组、CK 组和复合生物保鲜剂处理组PPO 活性随贮藏时间延长均呈现先急速上升后缓慢上升趋势，这与杨丰菊[37]研究真空渗透下不同钙处理双孢蘑菇中PPO 活性的反映大体一致，说明子实体内PPO 在胁迫环境中有重要作用。整个贮藏期间，复合生物保鲜剂处理组PPO 活性始终显著低于BC 组和CK 组（p＜0.05），特别是贮藏期2、4、6 d，PPO 活性几乎不变，分别为5525.86、5861.21 和5914.43 U/g FW。复合生物保鲜剂处理组在贮藏前后仅上升了3406.39 U/g FW，上升幅度仅为CK 组的33.93%、BC 组的60.08%。由此可知，复合生物保鲜剂能够有效延缓双孢蘑菇贮藏期间PPO 活性的增加。

2.4.2.2 总酚含量的变化及分析

植物体内存在某些次级代谢途径能够提高机体抗逆性，如苯丙烷代谢，其生成的酚类物质、木质素等有不同的抗逆活性[38]。苯丙氨酸酶（PAL）是苯丙烷代谢关键酶之一，其活性大小与酚类等物质含量高低密切相关[39]。木质素合成原料之一是酚类物质[40]，木质素有效积累会提高细胞抵抗病原菌侵染能力[41]。酚类物质作为非酶抗氧化系统的底物，其含量可影响机体氧化损伤和褐变程度[42]。由图10可以看出，在贮藏期内，复合生物保鲜剂处理组、BC 组和CK 组的总酚含量均呈现先上升后下降规律，这和LI 等[43]研究L-精氨酸对双孢蘑菇总酚含量的结果基本一致。不同的是，复合生物保鲜剂处理组在贮藏期第4 d 就已出现峰值（1.95 OD280/g FW），不仅快于BC 组和CK 组2 d，而且峰值含量分别是BC 组（1.69 OD280/g FW）和CK 组（1.58 OD280/g FW）的1.15 和1.58 倍并达到显著性水平（p＜0.05）。总酚含量的增加可能是由复合生物保鲜剂抑制了PPO 活性导致的。不难看出，在贮藏期2～8 d 内，复合生物保鲜剂处理组总酚含量均始终高于对照组（p＜0.05），并维持较高含量水平。从上述结果得知，复合生物保鲜剂处理可加快双孢蘑菇贮藏期间总酚含量峰值出现并促进酚类物质积累。

2.4.2.3 总抗氧化能力的变化及分析

植物遭遇不良胁迫时，其体内会立即产生活性氧簇（ROS）[44]，少量ROS 会提高植物体抗菌能力[45]，过多ROS 就会损伤细胞[46]，但机体存在ROS清除系统，可及时清除过量ROS 从而保护细胞[47]。DPPH 自由基和ABTS 阳离子自由基清除率均为衡量ROS 清除系统总抗氧化能力的重要指标。由图11（A）知，在整个贮藏期间，所有试验组DPPH自由基清除率均呈现逐渐下趋势，但复合生物保鲜剂处理组始终显著高于BC 组和CK 组（p＜0.05），它与对照组间差距在贮藏第4 d（81.55%）达到最大，高出BC 组22.23%以及CK 组22.34%，在贮藏第8 d 清除率依然高达66.08%，这表明复合生物保鲜剂处理可延缓DPPH 自由基清除能力的降低。由图11b 可知，随贮藏时间延长，三组处理的ABTS阳离子自由基清除率呈现先短暂上升后下降的趋势。复合生物保鲜剂处理组ABTS 阳离子自由基清除率在贮藏第2、6、8 d 三个时间点均显著高出对照组（p＜0.05），在贮藏期第2 d 达到峰值（90.34%），比BC 组峰值的出现提前2 d，并且下降速度远远低于对照组。这说明复合生物保鲜剂处理能够促进双孢蘑菇贮藏期间ABTS 阳离子自由基清除率峰值出现，并且可有效延缓菇体抗氧化能力的降低。

3 结论

本研究以双孢蘑菇为试验对象，通过白度值和感官评价双指标择优筛选，研究了茶多酚、L-谷氨酸、L-精氨酸和Vc 对子实体的抗氧化能力，大蒜提取液、ε-聚赖氨酸、Nisin 和生姜提取液的抑菌保鲜效果，以及果胶、黄原胶、卡拉胶和水溶性壳聚糖的成膜保鲜效果。初步结果表明，Vc、Nisin 和卡拉胶有效延缓子实体褐变、保持一定新鲜度。在此基础之上进一步研究，经复合优化得到的复合生物保鲜剂（Vc 0.80 g/L、Nisin 0.40 g/L、卡拉胶5.40 g/L），能够有效延缓双孢蘑菇硬度下降、失重率和腐烂率的上升，提高采后抗氧化能力，延缓酚类物质含量和自由基清除能力的降低、抑制PPO 活力增加，延长货架期3～4 d。但是本研究仅仅是在短期低温条件下，通过复合生物保鲜剂处理，对双孢蘑菇失重率、硬度、腐烂率、总酚含量、PPO 活性、DPPH 自由基和ABTS 阳离子自由基清除率的变化趋势进行了研究，将来可对ROS 清除系统相关酶活性和营养物质含量的变化进行研究，还可以对这些变化产生的原因或机理展开更深入的研究，以便更加全面地解释复合生物保鲜剂对双孢蘑菇衰老的影响。