基于中医传承辅助平台和网络药理学探讨刘华宝教授治疗肝硬化的用药规律*

肝硬化是各种慢性肝病进展至以肝脏弥漫性纤维化、假小叶形成、肝内外血管增殖为特征的病理阶段，失代偿期可并发腹水、消化道出血、肝性脑病，甚至肝癌等严重后果

。中医学并无此病名记载，根据肝硬化的病理变化和表现，可将其归纳于“积聚”“胁痛”“黄疸”等范围。中医认为多种因素综合作用于机体，导致肝络瘀滞不通、疏泄失职，肝体失柔，而发展为肝硬化

。中医药在改善肝硬化症状和肝功能、改善肝内血液循环、调节免疫等方面的优势已成为中西医共识

。刘华宝教授是重庆市名中医，第三批全国优秀临床人才，国务院特殊津贴获得者，重庆市中医院肝病科主任，硕士研究生导师，从医30余年，治疗慢性肝病的经验丰富。本研究基于中医传承辅助平台和网络药理学联合应用的方法，通过收集、整理刘华宝教授门诊治疗肝硬化的方剂，总结刘华宝教授治疗肝硬化的用药规律，并进一步对核心药物的潜在作用靶点和信号通路进行分析，为肝硬化的防治和药物的开发提供思路。

1 资料与方法

1.1 处方来源与筛选 收集整理2018年1月1日至2020年6月30日我院刘华宝教授门诊治疗肝硬化的有效处方。参照2019年《肝硬化诊治指南》和2019年《肝纤维化中西医结合诊疗指南》，筛选刘华宝教授门诊所有明确诊断肝硬化患者的治疗处方。根据2015年《中国药典》对中药名称进行统一，如“紫丹参”统一为“丹参”，“茵陈蒿”统一为“茵陈”等。

1.2 数据录入 利用中医传承辅助平台(v2.5)软件(由中国中医科学院中药研究所提供)，将上述筛选的处方录入中医传承辅助平台临床采集系统，分别录入患者相关信息，包括一般信息如姓名、性别、年龄等，诊疗信息如四诊、用药等。录入过程由单人录入、双人审核，以确保数据准确性，从而建立刘华宝教授治疗肝硬化的医案数据库。

1.3 数据分析 利用中医传承辅助平台中的多种分析功能，进行数据的统计分析，包括频次统计、组方规律、新方分析、网络展示等。药物频次和归经按照从大到小进行排序；四气和五味按照所占比例进行统计；基于关联规则的组方规律分析中设置支持个数为20，置信度为0.9，通过“规则分析”获得药物组合出现的频次和置信度，按照出现频次和置信度从大到小进行排序；基于熵聚类分析法的新方分析中，设置相关度为10，惩罚度为6，分析获得核心药物组合，并在此基础上获得新方组合。

1.4 核心药物潜在靶点分析 将中医传承辅助平台分析获得的核心药物导入中药分子机制的生物信息学分析工具(BATMAN-TCM)数据库，参数使用数据库默认值Score cutoff为20，Adjusted P value为0.05，分析获得核心药物的活性成分和潜在靶点，并构建核心药物的“成分-靶点-通路-疾病”网络图。对潜在靶点进行生物学功能基因本体论(GO)功能注释，采用京都基因与基因组百科全书(KEGG)进行信号通路富集分析。

<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 用药频次 筛选出刘华宝教授治疗肝硬化相关疾病门诊处方99首，其中所包含中药188味，出现频次≥20次的中药有25味，见表1。排名前10位的分别是柴胡、黄芩、丹参、白术、鳖甲、佛手、郁金、茯苓、白芍、当归。

58到家今年员工已经有6000多人，在我看来，全世界只有两家家政公司，一家叫58到家一家叫其他。58到家现在还在持续投入技术研发，要养活很多员工，做很多产品，但这些投入都不是靠外面的输血。关注好自己，就会发现自己活得越来越好，规模不停壮大，时间就会把你推上去。

2.6 核心药物的生物信息学分析 将中医传承辅助平台分析获得的核心药物柴胡、黄芩、丹参、白术、鳖甲五味药导入BATMAN-TCM数据库进行生物信息学分析，预测获得82个有结构信息的化合物，包括Beta-humulene(β-葎草烯)、Caryophyllene(石竹烯)、8-nonenoic acid(8-壬烯酸)、Alpha-linolenic acid(α-亚麻酸)和Alpha-limonene(α-柠檬烯)等。核心药物的潜在靶点包括醇脱氢酶1C(ADH1C)、胆固醇侧链裂解酶(CYP11A1)、钙电压门控通道亚单位α1D(CACNA1D)、钙电压门控通道亚单位α1A(CACNA1A)、N-甲基-D-天冬氨酸NMDA受体亚基2A(GRIN2A)、腺苷受体A1(ADORA1)、雌激素受体1(ESR1)、钠电压门控通道α亚基5(SCN5A)、白细胞介素1β(IL1B)、钾电压门控通道亚家族Q成员1(KCNQ1)和利钠肽A(NPPA)等。潜在靶点关联的疾病包括疼痛、偏头疼、哮喘、不明原因疼痛、心律失常和止痛剂等(图4)。

2.4 核心药物网络展示图 设置支持个数为20，置信度为0.9，利用“网络展示”功能得到核心药物网络展示图，共6味中药，分别为柴胡、黄芩、丹参、白术、鳖甲、佛手(图3)。

2.5 新方组合 基于复杂系统熵聚类分析，设置相关度为10，惩罚度为6，进行聚类分析，利用熵层次聚类分析法对分析结果进行提取，得到核心药物组合和新处方13首(表4、表5)。

例4.Shantou,then known as Swatow,was China’s third-largest port after Shanghai and Guangzhou and the port of departure of the Teochew diaspora...(China Daily,2018-05-23)(汕头，广州，潮州）

2.3 基于关联规则的组方规律 利用中医传承辅助平台中的组方规律分析功能，设置支持个数为20，置信度为0.9，以药物组合出现的频次进行排序，共有20个频次≥20次的药物组合，其中出现频次前5的药物组合由黄芩、柴胡、丹参、鳖甲和佛手组成(表3)。

近年来，南通大学医学院在五年制医学临床本科专业采用PBL教学，我院对在急诊外科的实习生也采用PBL教学进行探索，我科在在泌尿外科见习生也试行PBL教学，在这方面也取得良好的效果[2-3]。在此基础上，为探索泌尿外科住院医师规范化培训的PBL 教学方法，转变现行的教学模式，切实提高住院医师解决实际问题的能力，进行了本研究。

以药物组合的置信度进行排序，共有43个置信度≥0.9的药对，其中出现置信度为1 的药物组合由当归、柴胡、鳖甲、丹参、黄芩和佛手组成，表明这些药物是刘华宝教授治疗肝硬化最常用的药物(表2)。

2.2 药物性味、归经 结果显示四气频次最高的为寒性，其次为温性(图1A)。五味中频次最高的为苦味，辛味次之，具体结果见图1B。药物归经频次最高为肝经，其次为脾经、胃经(图2)。

本研究运用中医传承辅助平台和网络药理学的方法分析了重庆市名中医刘华宝教授治疗肝硬化的用药规律。研究结果显示，刘华宝教授治疗肝硬化常用药物包括柴胡、黄芩、白术、丹参、鳖甲等，药物功效分类显示主要为疏肝健脾、活血祛瘀、软坚散结等类药。从四气五味的分析结果看，性寒，味苦辛，归肝、脾经的药物最多。刘华宝教授认为诸因所致肝硬化，必伴见肝的气血阴阳发生异常变化，藏化于内属肝的气阴两虚，血行不畅；变现于外属气机失常和体用失调，病理过程各有所偏，或气(阴)虚为主，或血瘀为主，瘀血阻络既是致病因素，亦是病理产物，即实质为肝脾气虚、络脉瘀阻，故治疗法则为燮理体用，燮理气机，和络逐瘀

。徐列明等

认为肝硬化的基本病机为正虚邪盛、肝络受损、气滞血瘀，治法当以益精养肝、活血祛瘀、软坚散结为主，与本研究的分析结果基本一致。

3 讨论

进一步的KEGG富集分析提示核心药物的潜在靶点主要富集于Neuroactive ligand-receptor interaction、Calcium signaling pathway、CGMP-PKG signaling pathway、Oxytocin signaling pathway和Retrograde endocannabinoid signaling等信号通路(图5)，由此可知核心药物的潜在靶点主要涉及信号分子相互作用、神经内分泌系统和氨基酸代谢等信号通路。潜在靶点的生物学过程主要富集于Ion binding、Signal transducer activity、Cytoplasm、Plasma membrane、Signal transduction、Response to stress等，由此可知核心药物的潜在靶点主要涉及的生物学过程包括细胞间相互信号转导、细胞增殖、脂肪酸代谢等过程(图6)。

柴胡具有疏肝理气升阳的功效，黄芩具有泻火解毒利胆的功效，柴胡、黄芩合用，可升清阳，降浊阴，调转厥阴少阳、燮理阴阳升降之枢机。白术具有健脾益气、燥湿利水的功效。鳖甲软坚散结，丹参活血通络，二者合用具有强化和络逐瘀之效。现代研究显示，柴胡的主要生物活性成分为柴胡皂苷，在减轻肝脏炎症、抗肝纤维化方面发挥重要作用。在肝炎细胞和动物模型中，柴胡皂苷d可通过抑制NLRP3炎症小体信号通路，降低炎症因子IL1β、IL18的水平，升高肝脏细胞内抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)等的活性，降低氧化应激产物丙二醛(MDA)等的水平，从而减轻肝脏炎症，抑制肝脏纤维化形成

。本研究基于关联规则的组方规律分析结果显示柴胡和黄芩组合频次最高。柴胡和黄芩在临床中常作为药对使用，如经典方剂小柴胡汤中柴胡和黄芩配伍使用。黄芩中的主要成分为黄芩苷、黄芩素等，具有抗炎抗氧化、调节免疫等作用

。研究显示与柴胡、黄芩单用相比，柴胡黄芩配伍使用时不仅柴胡皂苷和黄芩苷的煎出量有一定的增加，而且药对的抗炎抗氧化能力也有一定的增强

。丹参主要药效成分为丹参酮、隐丹参酮等，是近年研究的热点，广泛应用于多种肝脏疾病如肝纤维化、药物性肝损伤等肝脏疾病的防治研究中，且有部分成分已开发为新药应用于临床。丹参酮类成分具有调节NF-κB炎症信号通路和Nrf2/HO-1氧化应激信号通路的作用，从而抑制TGF-β、IL6等炎症因子的释放，降低氧化应激产物MDA的水平，通过上述抗炎抗氧化的作用，对肝纤维化产生保护作用

。临床上白术常作为复方中的药味之一应用于酒精性肝纤维化的治疗

，目前尚缺乏其在肝硬化中的机制研究。鳖甲应用于肝硬化的治疗已久，复方鳖甲软肝片、鳖甲煎丸等均是以鳖甲作为主要药味而开发出的治疗肝纤维化、肝硬化的中成药，现已在临床中得到广泛应用

。本研究基于复杂系统熵聚类新方分析共获得13首新方，各新方功效侧重不同。例如，“白芍、连翘、川楝子、白花蛇舌草”的新方组合具有清热解毒、疏肝止痛的功效，“鳖甲_莪术_白花蛇舌草_水蛭”具有消积活血止痛的功效，临床上可根据患者病症不同而选择加减。但上述结果是基于数据分析而获得，其治疗肝硬化的疗效尚待进一步验证。

某煤气化项目采用壳牌Hybrid下行水激冷粉煤气化工艺，生产6×104 m3/h有效气CO和H2。其中煤粉储仓自身质量约28.5 t，最大荷载75 t，该设备基础支撑点采用4个，通过查询称重传感器的选型手册，k1=0.35， k2=0.85，k3=2.5。

11月16日，10个新成立的农村集体经济组织获得了农业农村部颁发的登记证书。目前，全国已有超过13万个农村集体经济组织完成改革，共确认集体成员2亿多人。

本研究进一步运用网络药理学对高频核心药物柴胡、黄芩、白术、丹参和鳖甲进行分析，获得潜在作用的靶点、信号通路和生物学过程。潜在作用靶点主要包括与炎症相关的IL1β，与激素调节相关的ESR1、CACNA1D、CACNA1A，与乙醇分解代谢相关的ADH1C、ADORA1，与代谢有关的CYP11A1，和与水液代谢有关的NPPA等。信号通路和生物学过程富集分析结果主要与细胞间相互信号转导、细胞增殖、脂肪酸代谢等有关。在多种病因的刺激下，肝脏中出现代谢异常、炎症反应、免疫反应等，导致肝脏实质细胞损伤，发展为肝硬化，其中涉及复杂的病理生理过程。肝脏炎症是肝纤维化、肝硬化形成的使动因素，也贯穿于肝硬化的病理过程中。致炎因子IL1β可由TLR4/NF-κB信号通路及NLRP3炎症小体共同调节表达，其可通过调节细胞炎症和氧化应激影响肝硬化进程。而既往有研究显示柴胡中的主要成分柴胡皂苷d可通过调控NLRP3炎症小体抑制IL1β表达，减轻四氯化碳诱导的肝细胞损伤

，这与本研究的药物和靶点分析结果一致。多项研究显示醇脱氢酶ADH1C基因的多态性与酒精性肝硬化的易感性密切相关，其突变杂合子等位基因可增加罹患酒精性肝硬化的风险

。目前尚缺乏其他潜在靶点在肝硬化中的研究，但同时也提示它们可能作为肝硬化诊断或治疗研究的新靶点。

综上所述，本研究基于中医传承辅助平台和网络药理学的分析方法，挖掘了刘华宝教授治疗肝硬化的遣方用药规律，分析出常用药物及药物组合，由此挖掘出新方组合，并进一步对核心药物进行了靶点和信号通路的分析，对深入理解和传承刘华宝教授治疗肝硬化的学术经验和思想提供了思路和方法。但以上研究是基于数据分析所获得，核心药物的获得仅是根据药物使用频次等参数进行筛选，而非从学术理论和对中药的认识出发所获得，尚需进行中医理论和基础研究的验证。

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