基于生物信息学探究miR-17-5p 促进三阴性乳腺癌增殖迁移的机制

贺 鑫 陈芳芳 龚鹏举 宋文静 杨 燕 钱 晨 何浩东 张京伟

1武汉大学中南医院甲乳外科/湖北省肿瘤生物学行为重点实验室/湖北省肿瘤医学临床研究中心 湖北 武汉 430071；

2武汉大学基础医学院病理生理学教研室 湖北 武汉 430071

乳腺癌是全世界最常见的女性恶性肿瘤之一，严重影响女性的生命健康。最新统计数据表明，2020 年全世界新发乳腺癌病例约226 万，约占全世界新发癌症病例的11.7%，死亡病例约68 万例，同时乳腺癌首次取代肺癌（220 万，11.4%）成为全世界最常见的恶性肿瘤［1］。

乳腺癌是一种高度异质性的肿瘤，其中三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）的侵袭性最高，易出现复发及转移［2］。由于三阴性乳腺癌中雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体-2（HER-2）均为阴性，患者无法从内分泌治疗及抗HER-2 靶向治疗中获益，目前仍以化疗为主。高侵袭性及治疗药物的受限导致三阴性乳腺癌患者的5 年死亡率较高，成为了乳腺癌治疗的难点。

microRNA 是近年来被广泛研究的内源性非编码RNA，长约21～23 nt，可以通过完全或不完全结合靶基因mRNA 的3'UTR 区来抑制靶基因的表达，从而在生物的生长发育及疾病的发生发展中发挥重要作用［3］。在乳腺癌中，已有多个microRNA被报道为增殖、转移、复发、预后或治疗反应的潜在生 物 标 志 物［4］。miR-483-3p 能 通 过 靶 向 癌 基 因HDAC8 抑制人类三阴性乳腺癌细胞的增殖转移［5］。miR-25-3p 在三阴性乳腺癌组织和细胞系中被上调并能通过靶向BTG2 促进肿瘤增殖，可能作为TNBC 新的诊断和治疗靶标［6］。这些研究提示microRNA 在TNBC 的发生发展中发挥重要调控作用，并成为新型诊疗分子标志物。

本研究通过对肿瘤基因组计划（The cancer genome atlas，TCGA）数据库中乳腺癌microRNA 测序数据的分析，筛选出与TNBC 预后相关的特异性差异表达上调microRNA，选取miR-17-5p 作为研究对象，通过相应实验进行验证，并结合多个生物信息学数据库探索miR-17-5p 下游相关靶基因及相关分子机制，从而初步阐释miR-17-5p 在TNBC 发生发展过程中的生物学作用。

1 材料与方法

1.1 生物信息学分析方法

1.1.1数据来源 在UCSC Xena 网站（https：//xena.ucsc.edu/）下载TCGA 数据库中乳腺癌microRNA IlluminaHiseq 测序数据及对应临床信息数据。

1.1.2筛选TNBC 预后相关的特异性差异表达microRNA 排除临床信息不完整及miRNA 测序数据有缺失的病例，按照分子分型筛选出TNBC 及非TNBC 数据，使用R 语言（3.6.2）limma 包分析TNBC 及非TNBC 中癌组织相对癌旁组织的差异表达microRNA，使用Venn 图筛选出TNBC 的特异性差异表达microRNA，当|log2FC）|＞1 且P＜0.05时认为该microRNA 表达具有显著性差异。利用在线生存分析网站Kaplan Meier Plotter（https：//kmplot.com/analysis/）采用Kaplan-Meier 方法经Logrank 检验，通过计算上四分位数和下四分位数之间所有可能的分界值，选取其中最佳的阈值作为分界点，将患者分为高及低表达两组，并分析其生存情况，进而筛选出与TNBC 预后相关的差异表达microRNA。

1.1.3分析TNBC 预后相关microRNA 的下游基因 使 用Starbase 数 据 库（http：//starbase. sysu.edu.cn/index.php）结合多种方法（miRanda：http：//www. microrna. org/microrna/getMicroRNAForm.do，PicTar：https：//pictar.mdc-berlin.de/，miRmap：https：//mirmap. ezlab. org/，Targetscan7.2：http：//www. targetscan. org/vert_72/，PITA：http：/genie.weizmann. ac. il/pubs/mir07/）预测miR-17-5p 的下游靶基因，筛选5 个工具预测结果中的交集靶基因。通过Metascape 及STRING 数据库对靶基因进行功能及信号通路聚类分析，并构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。结合在线生存分析网站Kaplan Meier Plotter 对关键基因进行生存分析。通过在线网站UALCAN 分析TCGA数据库不同类型乳腺癌组织样本中FBXL5 的表达水平。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养及转染 乳腺上皮细胞系MCF-10A 及人乳腺癌细胞系（MCF-7 及MDA-MB-231细胞）购买于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。细胞使用含10% 胎牛血清（Gibco，美国）及1% 青霉素-链霉素（Invitrogen，美国）的DMEM（Gibco，美国）完全培养基，在37 ℃，5% CO2的恒温培养箱中培养。定期换液，待细胞密度为60%～70%时选取处于对数生长期细胞进行转染。miR-17-5p 的mimics、inhibitor 及 相 应NC 订 购 于 吉玛基因，严格按照产品说明书转染，转染后MDAMB-231 细胞分为：①Mimics-NC 组；②Mimics 组；③Inhibitor-NC 组；④Inhibitor 组。

1.2.2实时荧光定量PCR 收集各组待测细胞，根据RNA 提取试剂盒（北京庄盟生物）说明书提取细胞总RNA。根据逆转录试剂盒（Thermo，美国）说明书，逆转录合成cDNA。qPCR 使用20 μL 反应体系，包括cDNA 1 μL，2×SYBR Green Mix（Bio-Rad，美国）10 μL，引物0.4 μL，灭菌蒸馏水9 μL。反应条件为：95 ℃3 min、95 ℃12 s、58 ℃15 s、72 ℃30 s，40 个 循 环。以U6 为 内 参，采 用2-ΔΔCT法 计 算miR-17-5p 相对表达量。引物订购于华大基因：miR17 - 5p：（forward） 5' - AACAGTGCAAAGTGCTTACAGT - 3'，（reverse） 5' - GTCGTATCCAGTGCAGGGT - 3'；U6：（forward） 5' - CTCGCTTCGGCAGCACA - 3'；（reverse） 5' - AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.3CCK-8 实验 细胞转染12 h 后，按照2×103/孔的密度接种于96 孔板，每组6 个复孔。完全DMEM 培养基常规培养24、48、72 h 后，向每孔中加入10 μL CCK-8 试剂（北京庄盟生物），培养箱静置2 h 后检测各组细胞的OD450nm值。

1.2.4划痕实验 细胞转染12 h 后，按照1×105/孔的密度接种于6 孔板，完全DMEM 培养基常规培养，待细胞密度100%时划线，分别于0、24、48 h 后低倍显微镜下拍照记录。

1.3 统计学方法采用SPSS 24.0 及Graph Pad Prism 7 进行统计分析，研究结果以均数±标准差表示，使用t检验和方差分析比较各组间差异，P＜0.05 时差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TNBC 预后相关的特异性高表达microRNA经筛选后共纳入67 例TNBC 样本、334 例非TNBC 样本及76 例正常乳腺组织样本。如图1 所示，经生物信息学分析，共筛选出98 个TNBC 特异性高表达microRNA 及11 个TNBC 特异性低表达microRNA。

图1 TNBC 中特异性差异表达的microRNA（TCGA）

在98 个TNBC 特异性高表达microRNA 中，进一步筛选出9 个log2FC＞2 的microRNA（表1），并选择miR-17-5p 做后续分析与研究。通过Kaplan-Meier 方法分析microRNA 与TNBC 总生存期（OS）的相关性。结果表明（图2）miR-17-5p（HR=1.56，95%CI：1～2.43）高表达与TNBC 患者预后不良显著相关（P＜0.05）。

图2 miR-17-5p 在TNBC 中特异性高表达且与不良预后相关

表1 三阴性乳腺癌中特异性高表达的9 个log2FC＞2 的microRNA

2.2 miR-17-5p 在TNBC 细胞中表达特异性升高首先分析了CCLE（cancer cell line encyclopedia）数据库里不同乳腺癌细胞系中miR-17-5p 的表达水平。结果表明（图3A），与非TNBC 细胞系相比，TNBC 细胞系中miR-17-5p 的表达水平显著升高（P＜0.05）。我们进一步检测了MCF-10A、MCF-7及MDA-MB-231 细胞中miR-17-5p 的表达水平。如图3B 所示，与正常乳腺上皮细胞MCF-10A 相比，TNBC 细 胞 系MDA-MB-231 中miR-17-5p 表 达显著升高（P＜0.001），而Luminal A 型乳腺癌细胞系MCF - 7 中miR - 17 - 5p 表达未显著升高（P＞0.05）。结果表明，miR-17-5p 在TNBC 细胞中表达特异性升高。

在TNBC 细胞系MDA-MB-231 中转染miR-17-5p mimics 及inhibitor 后，我们通过RT-qPCR 检测各组细胞中miR-17-5p 表达水平。如图3C 和3D 所示，与对照组相比，mimics 组细胞中miR-17-5p 表达水平显著升高（P＜0.001），而inhibitor 组细胞中miR-17-5p 表达水平显著降低（P＜0.01）。

图3 miR-17-5p 在不同类型乳腺癌细胞系中的表达水平

2.3 miR-17-5p 促进TNBC 细胞增殖及迁移能力为了检测miR-17-5p 对TNBC 细胞增殖及迁移能力的影响，我们分别在TNBC 细胞系MDA-MB-231 中 转 染miR-17-5p mimics 及inhibitor，通 过CCK-8 实验检测不同时间各组细胞的存活情况，划痕实验检测各组细胞划痕愈合情况。结果表明（图4），与对照组相比，过表达miR-17-5p 后细胞增殖及迁移能力显著增强，而抑制miR-17-5p 表达后细胞增殖及迁移能力显著减弱（P＜0.05）。

图4 miR-17-5p 对三阴性乳腺癌细胞增殖及迁移能力的影响

2.4 miR-17-5p 靶基因预测及相关调控机制分析使用Starbase 数据库对miR-17-5p 下游靶基因进行预测，共筛选出407 个交集靶基因。功能及信号通路聚类分析结果表明（图5A），miR-17-5p 的靶基因涉及到众多肿瘤相关功能及信号通路，如细胞蛋白降解、蛋白泛素化、细胞周期调节、TGF-β 信号通路等。此外，对构建的靶基因PPI 网络筛选关键子模块（图5B），结果主要涉及到5 个子网络：泛素化及蛋白酶体降解（Ubiquitination & Proteasome degradation）、mRNA 剪接（mRNA Splicing）、受体酪氨酸激酶通路（Signaling by Receptor Tyrosine Kinases）、细胞投射组件（cell projection assembly）及G1中 与Cyclin D 相 关 的 事 件（Cyclin D associated events in G1）。

图5 miR-17-5p 下游靶基因预测及PPI 网络

泛素-蛋白酶体途径在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用，我们选择此子网络（模块1）中的关键基因作进一步分析。为了探究泛素-蛋白酶体途径中关键基因对TNBC 患者总生存期的影响，我们使用Kaplan-Meier 方法及Log-rank 检验进行生存分析。结果表明（图6A），FBXL5（F-box and leucine rich repeat protein 5）的低表达与TNBC 患者预后不良密切相关（P＜0.05）。进一步通过UALCAN 在线分析TCGA 数据库不同类型乳腺癌患者样本中FBXL5 的表达水平，结果表明（图6B），与正常乳腺组织相比，TNBC 组织中FBXL5 的表达水平显著降低。通过Starbase 数据库进一步分析乳腺癌中miR-17-5p 与FBXL5 表达水平相关性，结果，miR-17-5p 与FBXL5 的mRNA 表达水平显著负相关（y=-0.244 4x+6.661 9，r=-0.498，P＜0.001）（图6C）。

图6 miR-17-5p 下游关键靶基因的筛选

由此我们推测，miR-17-5p 可通过抑制泛素-蛋白酶体途径中关键基因如FBXL5 的mRNA 表达水平，促进TNBC 的发生发展，从而影响TNBC 患者的预后。

3 讨论

乳腺癌现已超越肺癌成为全世界最常见的恶性肿瘤。而由于具有高侵袭性、治疗方案受限等特点，目前三阴性乳腺癌患者的预后依然较差。近年来越来越多的研究表明分子靶向治疗在三阴性乳腺癌的治疗中可发挥重要的作用，因此对三阴性乳腺癌治疗靶点的进一步探索具有重要意义。

将TNBC 组和非三阴性乳腺癌（Non-TNBC）组microRNA IlluminaHiseq 测序数据分别与正常乳腺组织比较后，经韦恩图分析，筛选出98 个在TNBC 中特异上调的microRNA，选取其中9 个log2FC＞2 的microRNA 进行生存分析，结果表明，miR-17-5p 高表达与三阴性乳腺癌患者预后不良显著相关。

越来越多的研究表明，microRNA 在癌症发生的发展中发挥重要作用，成为肿瘤早期诊断、治疗和预后评估的重要标志物。在已有研究中，miR-17-5p 在多种肿瘤中具有促癌的作用。如miR-17-5p 可通过靶向下游基因如RUNX3、PDCD4 等促进胃癌细胞增殖和侵袭［7，8］。在鼻咽癌中，miR-17-5p 通过靶向BAMBI 促进肿瘤血管生成［9］。而miR-17-5p在三阴性乳腺癌中的作用并不明确，因此本研究中，我们对miR-17-5p 做进一步探究。

我们首先检测了正常乳腺上皮细胞及不同类型乳腺癌细胞中miR-17-5p 的表达情况。结果表明，与正常乳腺上皮细胞相比，miR-17-5p 在三阴性乳腺癌细胞中表达特异性升高。为了进一步探究miR-17-5p 对三阴性乳腺癌细胞的影响，我们在MDA-MB-231 中分别转染miR-17-5p mimics 及inhibitor 后，通过CCK-8、划痕实验检测各组细胞的增殖及迁移能力。实验结果表明，过表达miR-17-5p后细胞增殖及迁移能力显著增强，而抑制miR-17-5p 表达后细胞增殖及迁移能力显著减弱（P＜0.05）。综上，miR-17-5p 在三阴性乳腺癌中表达升高，且促进三阴性乳腺癌细胞增殖及迁移能力。

为了进一步探究miR-17-5p 促进三阴性乳腺癌细胞增殖及迁移的机制，我们通过多工具对miR-17-5p 下游靶基因进行预测，并筛选出在泛素-蛋白酶体途径中发挥重要作用的基因FBXL5。FBXL5 是F-BOX 蛋白家族的成员之一，参与E3 泛素连接酶SCF（SKP1 - CUL1 - F box）复 合 物 的 组 成［10］。FBXL5 可通过影响基因转录、细胞周期、铁代谢、DNA 损伤修复、EMT 等过程，影响多种肿瘤的发生发展及耐药等。在肝癌中，FBXL5 的缺乏可通过影响细胞铁稳态促进肿瘤的发生［11］。而在结肠癌中，FBXL5 可通过调节PTEN/PI3K/AKT 信号通路促进肿瘤的发展［12］。FBXL5 在乳腺癌中的作用尚不明确。本研究中，生存分析结果表明FBXL5 的低表达与三阴性乳腺癌患者预后不良显著相关（P＜0.05）。同时，与正常乳腺组织相比，FBXL5在三阴性乳腺癌组织中表达水平显著降低。在乳腺癌中，miR-17-5p 与FBXL5 的mRNA 表达水平显著负相关。由此我们推测，miR-17-5p 可通过抑制泛素-蛋白酶体途径中关键基因如FBXL5 的mRNA表达水平，促进三阴性乳腺癌的发生发展，从而影响三阴性乳腺癌患者的预后。

近年来，越来越多的研究对microRNA 在肿瘤发生发展中的作用机制进行探索。本研究通过生物信息学及实验对miR-17-5p 在三阴性乳腺癌中的作用进行了分析，初步推测miR-17-5p 可通过下调泛素-蛋白酶体途径中关键基因如FBXL5 的表达来促进三阴性乳腺癌的发生发展，为寻找新的三阴性乳腺癌诊断标志物、治疗靶点等提供了理论基础。在后续研究中，我们将进一步探索泛素-蛋白酶体途径关键基因对三阴性乳腺癌的影响，从而明确miR-17-5p 调控三阴性乳腺癌的具体机制。