三氯乙烯致L-02细胞毒性中SET蛋白介导的组蛋白泛素化及类泛素化修饰鉴定

杨思霞，李深盼，任晓虎，陈 效，刘云岗，刘建军

（1.南方医科大学公共卫生学院，广东 广州 510515；2.深圳市疾病预防控制中心深圳市现代毒理学重点实验室，深圳市卫生毒理学医学重点学科，广东 深圳 518055）

三氯乙烯（trichloroethylene，TCE）是无色易挥发有机溶剂，可通过呼吸道、消化道及皮肤接触等途径进入人体，流行病学调查发现，TCE暴露工人发生严重肝损伤［1］。啮齿类动物长期高剂量TCE暴露，可致肝癌［2］。TCE依赖细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）酶在肝中代谢［3］。经过CYP2E1代谢活化后，TCE及其代谢产物可引起小鼠肝全基因组DNA低甲基化及肝细胞组蛋白高乙酰化改变［4-5］。

组蛋白泛素化（ubiquitination）是一种在组蛋白上广泛存在且与染色质变化紧密联系的一种修饰，占总修饰中约16%［7］。泛素化蛋白被胰酶酶解后，只保留共价结合在底物蛋白赖氨酸上的2个甘氨酸，因此可通过识别泛素残余基序抗体KGG抗体来特异性富集泛素化多肽［7］。小泛素样修饰物（small ubiquitin-like modifer，SUMO）修饰（类泛素化修饰）有3种存在形式，也可通过特异性抗体对类泛素化修饰多肽进行富集。泛素化及类泛素化分子在激活酶（E1）、结合酶（E2）和连接酶（E3）作用下连接于底物，使自身经历成熟、激活、结合和连接4个步骤后，最终共价结合至靶蛋白特定赖氨酸位点，使靶蛋白活性发生改变，参与调节蛋白稳定性及其他生物学功能［8］。由于结构与泛素化高度相似，类泛素化修饰位点同样为赖氨酸［9］。因此，泛素化和类泛素化可通过竞争与蛋白质中相似赖氨酸残基相互作用，调控部分蛋白质功能［10］。已有研究表明，泛素化和类泛素化协同在调节肝炎症反应中起关键作用［10-11］。

本课题组前期研究表明，目标蛋白是TCE致肝细胞毒性的关键蛋白［12］，与SET蛋白相关的TCE肝毒性研究主要集中于组蛋白磷酸化、甲基化和乙酰化［13-16］，缺乏对泛素化及类泛素化修饰的研究。为全面探讨TCE致肝细胞毒性中相关组蛋白修饰及与SET相关的组蛋白泛素化及类泛素，本研究以人正常肝细胞L-02及SET稳定低表达的L-02细胞（SET-siRNA细胞）为对象，采用定量蛋白质组学技术筛选TCE处理引起的相关组蛋白泛素化和类泛素化，探讨TCE致肝细胞毒性中与SET蛋白相关泛素化与类泛素化，为揭示TCE致肝细胞毒作用相关表观遗传机制提供新线索。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

正常人肝细胞L-02购自中国科学院上海细胞生物学研究所；SET-siRNA细胞由本课题组前期构建［17］。精氨酸残基 C端剪切蛋白酶（clostripain，Arg-C）和碘化丙啶，美国Promega公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶和增强化学发光法显色反应试剂盒，美国Santa Cruz公司；受试物TCE、二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、Tris和二甲基标记试剂甲醛（formaldehyde，CH2O），美国Sigma公司；辣根过氧化酶，美国Bio-Rad公司；氰基硼氢化钠、磷酸二氢钠（NaH2PO4）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）和Pierce C18-离心柱，美国Thermo Fisher Scientific公司。EksigentnanoLC-2D型二维纳升液相色谱，美国Eksigent Technologks公司；ChromXP C18纳米液相色谱柱和Waters Q-TOF质谱仪，美国Thermo公司。

1.2 细胞培养和染毒处理

L-02细胞和SET-siRNA细胞均采用含100KU·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素和含12%胎牛血清的完全RPMI 1640培养基于37℃，5%CO2细胞培养箱培养。取对数生长期细胞平铺于六孔板中，待细胞生长至80%融合度后进行染毒。TCE溶解于DMSO，染毒溶液中DMSO的终浓度（体积百分比）为0.5%。同时设2种细胞0.5%DMSO对照组。染毒组设定剂量为1/2半数抑制浓度（half-inhibit concentration，IC50），即 8.0 mmol·L-1［18］，染毒24 h。

1.3 组蛋白的提取、分离和胶内酶切

分别收集3批2种细胞的DMSO对照组细胞及经TCE染毒处理L-02细胞和SET-siRNA细胞，用预冷PBS洗涤，重复3次。按Shechter等［19］报道方法提取、纯化及分离组蛋白，每5×109细胞加1 mL低渗裂解液，混匀置冰上裂解30 min；10 000×g，4℃离心10 min，弃上清，沉淀重悬于硫酸0.2 mol·L-1后置冰上至少30 min；16 000×g，4℃离心10 min以清除核碎片，转移上清至新1.5 mL离心管中；加入1/2体积TCE，振荡混匀，4℃过夜；离心弃上清，用预冷丙酮洗涤沉淀，16 000×g，4℃离心10 min，用移液管小心移弃上清，室温下风干沉淀后重溶于200 μL尿素6 mol·L-1中。利用乙酸尿素胶对组蛋白进行第1次分离；切下整个泳道置于SDS-PAGE胶上，对组蛋白进行第2次分离。分离组蛋白后切取目标蛋白点，经脱色、切碎、洗涤、干燥后置含0.2 μg Arg-C 蛋白酶的 100 mmol·L-1三乙碳酸氢铵（TEAB）溶液（pH=8.0）中，37℃酶解过夜。酶解完成后直接吸取酶解上清液即可获得多肽样品。

1.4 二甲基化标记

将1.3获得多肽样品，分别采用4%终浓度（体积百分比）CH2O，CH217O，CD2O和13CD2O在室温下反应1 h，进行二甲基化标记，加入终浓度（体积百分比）为1%氨水终止反应，并将样品混合。混合样品加入终浓度（体积百分比）为1%甲酸，利用Pierce C18离心柱除盐，按照说明书操作流程对样品进行脱盐处理，洗脱液旋转蒸干后用于质谱分析。

1.5 组蛋白泛素化、类泛素化鉴定和定量分析

酶解除盐干燥后的多肽样品溶解于10 μL缓冲溶液A（体积分数为0.1%的甲酸溶液）中，取溶解后多肽样品2 μL进行液相色谱分析。液相色谱流动相以250 nL·min-1的流速在120 min内通过分析柱，并使开始的5%缓冲溶液B（体积分数0.1%甲酸、体积分数95%乙腈的水溶液）线性变化至95%缓冲液B。液相色谱分离后多肽样品采用Waters Q-TOF质谱仪进行质谱分析。利用PLGS 2.5在IPI数据库检索所得质谱数据，分析组蛋白泛素化和类泛素化修饰图谱，同时利用limma软件包中的bioconductor对组蛋白泛素化和类泛素化多肽进行相对定量，并计算倍数比（multiple ratio）。倍数比=TCE组修饰水平/DMSO组修饰水平。倍数比＜1，P＜0.05，表明泛素化或类泛素化水平降低；倍数比＞1，P＜0.05，表明泛素化或类泛素化修饰水平升高。最后，根据IPI数据库检索报告，分析鉴定修饰水平具有统计学意义的组蛋白泛素化和类泛素化多肽序列和位点。

1.6 统计学分析

实验数据结果用±s表示，采用SPSS20.0软件进行统计学处理，采用单因素方差分析（one way ANOVA）方法，所有统计分析均为双侧检验，组间两两比较采用T检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TCE对L-02细胞毒性相关组蛋白泛素化修饰谱

表1结果显示，提取DMSO对照组和经TCE处理的L-02细胞的组蛋白，用液相色谱与质谱联用仪分析，共鉴定出31个组蛋白泛素化修饰位点，其中10个肽段中共有15个差异组蛋白泛素化位点与TCE肝毒性有关联（表1），有7个位点泛素化水平降低（倍数比＜1，P＜0.05），8个位点泛素化水平升高（倍数比＞1，P＜0.05）。其中1个位点（K16）位于组蛋白H2B，14个位点位于组蛋白H1。TCE致L-02肝细胞毒性相关组蛋白泛素化水平在各组蛋白上有不同改变（图1），主要泛素化集中于组蛋白H1，占93.3%；组蛋白H2B占6.7%。

Fig.1 Modification sites and types of ubiquitination in TCE treated L-02 and SET-siRNA cells.See Tab 1 and Tab2 for the treatment.

Tab.1 Histone ubiquitination modifications （Ubi） in trichloroethylene（TCE）treated L-02 cells identified by mass spectrometry

2.2 TCE对SET-siRNA细胞毒性中SET相关组蛋白泛素化修饰谱

SET-siRNA细胞经TCE染毒处理后，共检测出7个肽段中有10个差异组蛋白泛素化修饰位点（表2），其中组蛋白H2B的K16及组蛋白H1的K110和K186共3个位点的泛素化修饰水平在经TCE处理的L-02细胞中降低，而在SET-siRNA细胞中升高；组蛋白H1的K131，K137，K138和K148共4个修饰位点在经TCE处理的L-02细胞中升高，而在SET-siRNA细胞中降低，其余修饰位点的泛素化修饰水平在L-02细胞和SET-siRNA细胞中改变趋势近似。TCE致SET-siRNA细胞毒性中与SET相关组蛋白泛素化修饰主要集中在组蛋白H1，占90%；组蛋白H2B占10%（图1）。

Tab.2 Histone Ubi sites and peptide levels in TCE treated SET-siRNA hepatocytes identified by mass spectrometry

2.3 TCE对L-02细胞毒性相关组蛋白类泛素化修饰谱

质谱分析结果（表3）显示，L-02细胞经TCE染毒处理后，共鉴定出32个组蛋白类泛素化修饰位点，其中10个肽段中有17个差异组蛋白类泛素化修饰位点与肝细胞毒性有关，14个位点类泛素化水平降低，3个位点类泛素化水平升高。图2显示TCE致L-02肝细胞毒性相关组蛋白类泛素化修饰水平在各组蛋白上有不同改变，与肝细胞毒性有关17个类泛素化修饰位点中，16个位点集中于组蛋白H2B，占比94.2%；1个位点位于组蛋白H4，占比5.8%。

Fig.2 Modification sites and types of SUMO in TCE treated L-02 cells and SET-siRNA cells.See Tab.3 and Tab.4 for the cell treatment.

Tab.3 Histone small ubiquitin-like modifier（SUMO）modification sites and peptide levels in TCE treated L-02 cells identified by mass spectrometry

2.4 TCE对SET-siRNA细胞毒性中SET相关组蛋白类泛素化修饰谱

表4结果显示，SET-siRNA细胞经TCE染毒处理后，5个肽段中有9个组蛋白类泛素化修饰位点的修饰水平具有统计学差异。图2显示，经TCE处理后，组蛋白H2B的泛素化位点3第12修饰位点的类泛素化修饰水平在L-02细胞中升高，在SET-siRNA细胞中降低。泛素化位点1第6和12修饰位点，泛素化位点2第6修饰位点，泛素化位点3第12和13修饰位点的类泛素化修饰水平在L-02细胞中降低，而在SET-siRNA细胞中升高。其余修饰位点的类泛素化修饰水平在L-02细胞和SET-siRNA细胞中改变趋势近似。TCE致肝细胞毒性中与SET相关组蛋白泛素化位点化修饰集中于组蛋白H2B，占100%。

3 讨论

本研究利用定量蛋白质组学技术筛选TCE处理引起的相关组蛋白泛素化及类泛素化修饰，共鉴定出31个组蛋白泛素化位点，32个类泛素化位点，与TCE肝毒性相关的差异组蛋白泛素化位点15个，类泛素化位点17个。其中，TCE肝毒性受SET介导泛素化修饰位点10个，类泛素化位点9个。比较TCE染毒处理的L-02与SET-siRNA细胞发现，组蛋白H2B的K16及组蛋白H1的K110和K186泛素化修饰位点在TCE染毒处理后的SET-siRNA细胞中降低，K131，K137，K138和K148共4个泛素化位点在TCE染毒处理后的SET-siRNA细胞中升高，说明SET参与了由TCE诱发的肝细胞毒性组蛋白泛素化。组蛋白H2B K16类泛素化可促进包括GAL1在内的多种基因表达［20］。同样，SET也参与了TCE肝细胞毒性组蛋白类泛素化。结果显示，与L-02细胞比较，SET-siRNA细胞中组蛋白H2B K12类泛素化位点3的类泛素化水平降低；相反，SET-siRNA细胞中H2B K6类泛素化位点1和2，H2B K12类泛素化位点1和3以及H2B K13类泛素化位点3的类泛素化水平升高，表明SET蛋白可改变TCE致肝细胞毒性所引起组蛋白泛素化及类泛素化位点的变化趋势。

本研究结果表明，组蛋白H1和组蛋白H2B发生了较多TCE肝细胞毒性泛素化和类泛素化修饰位点改变。在裂殖酵母中，H2B单泛素化依赖Rhp6/Bre1泛素连接酶复合体发生在其C端119位赖氨酸（K119）［21］。组蛋白H1具有较多浓缩染色质结构［22］，使得组蛋白H1多泛素化成为DNA双链断裂反应中重要信号中间体［23］。组蛋白分子伴侣SET可调控发生在组蛋白H1上DNA损伤［24］。同时，组蛋白H2B单泛素化蓄积了较多活跃转录基因［25］，当泛素化特异性蛋白酶作用于组蛋白H2B上时，组蛋白H2B泛素化修饰可调节其他组蛋白多重修饰［26］。有研究表明，组蛋白H2B泛素化可以促进组蛋白H3 K4和H3 K79位点发生甲基化［27］。我们在前期研究中已确定TCE可致组蛋白H3 K79发生甲基化［16］，提示在TCE致肝细胞毒性中组蛋白H2B泛素化可能促进H3 K79甲基化发生。

综上所述，TCE处理L-02肝细胞可引起组蛋白泛素化修饰和类泛素化饰位点变化，且SET在其中发挥了重要作用，具体调控机制等还有待进一步研究。