蓝光光周期对甘蓝芽苗菜营养品质的影响

车功恒，张国华，肖军霞，3，李晓丹，3，郭丽萍，3*

（1.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109；2.青岛产品质量检验研究院，山东 青岛 266100；3.青岛特种食品研究院，山东 青岛 266109）

甘蓝（Brassica oleracea var.capitata）属十字花科芸薹属植物，也称包菜、大头菜、卷心菜，在我国种植面积非常广；富含膳食纤维、维生素（A、B1、B2、C）及矿物质（钙、铁、磷）；此外，还含有多种对人体有益的次生代谢产物，如硫代葡萄糖苷（简称硫苷）、酚类物质和花色苷等[1]。当植物细胞破碎时，黑芥子酶会释放出来与硫代葡萄糖苷结合形成水解产物，如异硫氰酸酯、硫氰酸酯、腈类和2-S恶唑烷等[2]，其中异硫氰酸酯是研究较多且具有重要生理活性的物质。研究表明，甘蓝具有降低血糖、抗癌、抗氧化、调节机体免疫力等功能，这主要与酚类物质和硫苷代谢产物等生物活性物质密切相关[3]。由于芽苗菜含有比成熟蔬菜更高的活性物质，其作为功能性蔬菜已被广泛食用，虽然甘蓝芽苗菜在我国还鲜有食用，但也引起了研究者的重视。

光作为一种环境因子，能够参与调控植物叶片光合作用、种子萌发、植物生长、调节气孔对外界环境变化的反应[4]。发光二极管（lighting emitting diode，LED）作为光源也可以调控芽苗菜的品质和次生代谢[5]。Chen等[6]研究发现蓝光处理下羽衣甘蓝芽苗菜中脂肪族硫苷含量最高，分别是红光和白光处理的1.6倍和2倍。Yamada等[7]研究发现，蓝光照射萝卜下胚轴10 min内，黑芥子酶活性显著增强，在30 min时活性最高，约为黑暗对照下的9.8倍。戚楠楠等[8]比较黑暗、白光、蓝光和紫外UV-A不同光质及光周期条件下对大豆芽苗花色苷含量的影响，结果发现蓝光照射处理24 h后，大豆芽苗中花色苷含量达到最大值（24 U/g FW），明显高于白光和黑暗处理。姜宗庆[9]发现蓝光处理香椿芽苗菜能够富集总酚和总黄酮含量，较白光处理分别提高了128.57%和204.76%；此外，还发现蓝光能够促进香椿芽苗体内抗坏血酸的生成，效果优于白光和红光。LED蓝光处理下能促进大白菜抗坏血酸基因生物合成以及转录水平，进而提高抗坏血酸含量[10]。蓝光在提高西兰花芽苗菜营养品质方面的效果优于白光、红光、绿光、黄光和紫光[11]。但关于蓝光光周期调控甘蓝芽苗菜生理生化及次级代谢产物的积累鲜有报道。

因此，本研究以“新夏50”和“紫红钻”两种甘蓝种子为试材，研究蓝光不同光周期对甘蓝芽苗菜的生长状况、抗坏血酸含量、花色苷含量、硫代葡萄糖苷含量、黑芥子酶活性、异硫氰酸酯形成的影响，旨在为蓝光用于甘蓝芽苗菜的工业化生产提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘蓝种子：寿光万和种业有限公司；DEAE Sephadex TMA25树脂：北京索莱宝有限公司；烯丙基硫苷标准品、萝卜硫素标准品、硫酸酯酶、葡萄糖试剂盒、抗坏血酸（分析纯）：美国Sigma公司；二氯甲烷、1，2-苯二硫醇、牛血清白蛋白、醋酸钠（分析纯）：国药集团（上海）化学试剂有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯）：天津科密欧化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

智能光照培养箱（RTOB-500B）：上海高致精密仪器有限公司；高效液相色谱仪（Thermo Ultimate 3000）：美国赛默飞公司；数显恒温水浴锅（HH-S2）：金坛市医疗仪器厂；离心机（TDL-40B）：上海安亭科学仪器厂；紫外分光光度计（UV-5100）：上海元析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甘蓝种子发芽条件

将甘蓝种子用1.5%的次氯酸钠浸泡15 min消毒，用蒸馏水冲洗至中性，于30℃蒸馏水浸泡3 h。将浸泡完的甘蓝种子均匀平铺在装有蛭石的培养盘中，于25℃培养箱中黑暗发芽1 d后，置于蓝光下培养，甘蓝种子距离灯源约40 cm，光周期分别为4、8、12、16、20 h/d和24 h/d，以黑暗条件下培养为对照，每天喷洒去离子水2次，于4 d时进行取样测定。

1.3.2 芽长及株重的测定

随机取20株甘蓝芽苗为一组，使用游标卡尺测量其芽长，使用电子天平测量其株重。

1.3.3 抗坏血酸含量的测定

参照Volden等[12]的方法，称0.2 g甘蓝芽苗，加4 mL2%的草酸溶液进行研磨，于10000×g离心15min，取1 mL上清液过0.45 μm膜，进行高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定。HPLC条件：色谱柱为SB-C18；波长为254 nm；流速为0.8 mL/min；柱温设置 30 ℃；进样量为 20 μL；流动相为0.1%甲酸-甲醇（体积比为95∶5）。抗坏血酸含量以鲜重计，用mg/100 g FW表示。

1.3.4 花色苷含量的测定

根据于海鑫等[13]的方法，称0.2 g甘蓝芽苗菜，加4 mL酸化乙醇快速研磨，10 000×g离心5 min，取上清液在535 nm处测量吸光度。花色苷含量用mg/100 g FW表示。

1.3.5 硫代葡萄糖苷含量的测定

选用Guo等[14]的方法，称0.5 g甘蓝芽苗，加4 mL煮沸的75%的甲醇溶液研磨，于80℃浸提15 min，10 000×g离心10 min，取1 mL上清液流经DEAE Sephadex A-25树脂后加入800 μL硫酸酯酶，于35℃反应16 h，过夜流掉后用3 mL蒸馏水冲洗，取1 mL上清液过0.45 μm膜，进行HPLC测定。HPLC条件：色谱柱为Agilent C18柱；波长226 nm；流速 1 mL/min；柱温30℃；进样量20 μL；流动相用20%乙腈和超纯水。硫代葡萄糖苷含量用μmol/g FW表示。

1.3.6 黑芥子酶活性的测定

根据王志英等[15]的试验方法，称0.5 g甘蓝芽苗菜，加入3 mL磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH6.5），在冰浴条件下研磨，于10 000×g冷冻离心15 min，所得上清液即为粗酶液。取0.5 mL粗酶液和0.5 mL烯丙基硫苷（1 mmol/L）充分混合，37℃恒温水浴锅反应10 min，于100℃灭酶5 min后用葡萄糖试剂盒测定。以每分钟被黑芥子酶转化生成1 nmol葡萄糖为一个酶活力单位。黑芥子酶活性用nmol/（min·mg prot）表示。

1.3.7 异硫氰酸酯含量的测定

选取Guo等[16]的方法，称甘蓝芽苗菜0.5 g，加4 mL蒸馏水研磨，于40℃利用内源酶酶解3 h，10 000×g离心15 min。取100 μL上清液，分别向其中加入200 μL 7 nmol/L 1，2-苯二硫醇、2 mL甲醇和1.8 mL 0.2 mol/L pH8.5硼砂缓冲液，混匀。65℃反应1 h，过0.45 μm滤膜，HPLC测定。HPLC条件为色谱柱：Agilent C18柱；波长：365 nm；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；流动相：甲醇-水（体积比为7∶3）。异硫氰酸酯含量用mg/100 g FW表示。

1.4 数据处理

所有试验均设3次重复，数据用SPSS 26进行显著性分析（p＜0.05），用 Mircosoft Excle 2013进行作图。

2 结果与分析

2.1 蓝光光周期对甘蓝芽苗菜芽长及株重的影响

蓝光光周期对甘蓝芽苗菜芽长及株重的影响见图1。

图1 蓝光光周期对甘蓝芽苗菜芽长及株重的影响Fig.1 Effect of blue light photoperiod on sprout length and weight of cabbage sprouts

由图1可知，与黑暗相比，蓝光处理显著抑制了甘蓝芽苗菜的生长（p＜0.05），与 Zhuang等[11]对西兰花芽苗菜的研究结果一致。在光周期为0～12 h/d，“新夏50”芽苗菜芽长明显高于“紫红钻”，但在 16 h/d～24 h/d，两个品种之间无显著差异。张欢等[17]报道指出，红光光周期从0延长到20 h/d，油葵芽苗菜下胚轴长逐渐降低，在20 h/d时达到最小值，本研究也得到相似结果，随着光周期的延长，甘蓝芽苗菜芽长不断降低，光周期为16 h/d～24 h/d，芽长变化不显著。同时，蓝光对拟南芥芽长的抑制作用也与本研究相似，研究认为这种抑制作用开始于阴离子通道介导的质膜去极化[18]。与对照组相比，蓝光处理使两种甘蓝芽苗的株重显著降低（p＜0.05），光周期为 24 h/d 时，“新夏 50”和“紫红钻”的株重分别比黑暗条件下减少了46.4%和55.2%，与芽长变化趋势一致。

2.2 蓝光光周期对甘蓝芽苗菜抗坏血酸含量的影响

蓝光光周期对甘蓝芽苗菜抗坏血酸含量的影响见图2。

图2 蓝光光周期对甘蓝芽苗菜抗坏血酸含量的影响Fig.2 Effect of blue light photoperiod on ascorbic acid content in cabbage sprouts

蓝光处理能够显著提高甘蓝芽苗菜的抗坏血酸含量（p＜0.05），随着光周期的延长，芽苗菜抗坏血酸含量整体呈现出先增加后降低的趋势，两个品种之间差异不明显。张欢等[19]研究表明，蓝光处理萝卜芽苗菜下胚轴中抗坏血酸含量最高，可能与抗坏血酸合成分解相关酶（半乳糖内酯脱氢酶、抗坏血酸氧化酶和抗坏血酸过氧化物酶）对光的响应机理不同。此外，还发现蓝光可促进拟南芥和烟草中的磷酸甘醇突变酶的表达，此酶与抗坏血酸生物合成基因密切相关，从而使抗坏血酸含量增加[20]。本研究中，“新夏50”在16 h/d抗坏血酸含量达到最高，“紫红钻”在12 h/d抗坏血酸含量最高，分别是对照组的1.86倍和1.72倍。

2.3 蓝光光周期对甘蓝芽苗菜花色苷含量的影响

蓝光光周期对甘蓝芽苗菜花色苷含量的影响见图3。

图3 蓝光光周期对甘蓝芽苗菜花色苷含量的影响Fig.3 Effect of blue light photoperiod on anthocyanin content in cabbage sprouts

研究表明，光照处理通过提高花色苷合成通路中相关基因表达水平实现花色苷的积累[21]。蓝光处理提高花色苷合成途径中苯丙氨酸解氨酶及查尔酮异构酶活力，从而提高西兰花芽苗菜中的花色苷含量[22]。由图3可知，蓝光处理显著提高甘蓝芽苗菜中花色苷含量（p＜0.05），光周期为 20 h/d 时，“紫红钻”芽苗菜花色苷含量为66.07 mg/100 g FW，是对照的9.14倍。“新夏50”芽苗菜在光周期24 h/d时花色苷含量最高，为20.53 mg/100 g FW，为对照组的10.98倍。“紫红钻”芽苗菜花色苷含量明显高于“新夏50”。

2.4 蓝光光周期对甘蓝芽苗菜硫代葡萄糖苷含量的影响

蓝光光周期对甘蓝芽苗菜硫代葡萄糖苷含量的影响见表1。

表1 蓝光光周期对甘蓝芽苗菜硫代葡萄糖苷含量的影响Table 1 Effect of blue light photoperiod on glucosinolate content in cabbage sprouts μmol/g FW

研究发现，植物品种不同硫苷含量差异很大[15]。本研究中两种芽苗菜硫苷种类和含量也不同，“新夏50”和“紫红钻”芽苗菜中均以脂肪族硫苷为主，分别占总硫代葡萄糖苷的95.91%和86.63%；“新夏50”芽苗菜中最多的硫苷为2-丙烯基硫苷，3-甲基亚磺酰基丙基硫苷次之，而紫红钻”芽苗菜中3-甲基亚磺酰基丙基硫苷含量最高；但芳香族硫苷未在“新夏50”中检测到。蓝光处理明显提高了两种甘蓝芽苗中硫苷含量，与黑暗相比，脂肪族硫苷、芳香族硫苷和吲哚族硫苷含量都有不同程度的增加。在光周期16 h/d时，“新夏50”甘蓝芽苗中总硫代葡萄糖苷含量达到最大值，为22.23 μmol/g FW，比对照增加了81.91%；2-丙烯基硫苷和3-甲基亚磺酰基丙基硫苷较对照相比增加了66.45%和43.02%。“紫红钻”甘蓝芽苗菜中总硫代葡萄糖苷含量在光周期12h/d时最高，是黑暗处理下的2.23倍，3-甲基亚磺酰基丙基硫苷较对照组提高63.92%。

2.5 蓝光光周期对甘蓝芽苗菜黑芥子酶活性的影响

蓝光光周期对甘蓝芽苗菜黑芥子酶活性的影响见图4。

图4 蓝光光周期对甘蓝芽苗菜黑芥子酶活性的影响Fig.4 Effect of blue light photoperiod on myrosinase activity in cabbage sprouts

光处理能够诱导黑芥子酶基因表达并提高其活性[7]。如图4所示，不同蓝光光周期下，两种甘蓝芽苗菜的黑芥子酶活性变化基本一致，呈折线型变化。与黑暗相比，蓝光处理降低了“新夏50”甘蓝芽苗菜的黑芥子酶活性，在4 h/d蓝光处理黑芥子酶活性最低，较对照降低77.08%；光周期4 h/d～24 h/d黑芥子酶活性不断增强，然后又持续下降。“紫红钻”黑芥子酶活性则不同于“新夏50”，光周期为12 h/d和16 h/d时黑芥子酶活性略高于对照组，12 h/d时蓝光处理活性最高，为24.75 nmol/（min·mg prot），20 h/d时活性最低，为5.61 nmol/（min·mg prot）。本研究结果表明蓝光光周期对不同品种植物的黑芥子酶活性影响也不同，这可能与黑芥子酶基因表达有关，但具体机理还有待于深入研究。

2.6 蓝光光周期对甘蓝芽苗菜异硫氰酸酯含量的影响

蓝光光周期对甘蓝芽苗菜异硫氰酸酯含量的影响见图5。

图5 蓝光光周期对甘蓝芽苗菜异硫氰酸酯含量的影响Fig.5 Effect of blue light photoperiod on isothiocyanate content in cabbage sprouts

异硫氰酸酯是硫代葡萄糖苷在黑芥子酶的作用下形成的产物之一，也是十字花科植物中起重要生理功能的物质。异硫氰酸酯主要来自于脂肪族硫苷和芳香族硫苷，而吲哚族硫苷降解生成的异硫氰酸酯非常不稳定，会迅速降解生成其它产物，如GB的最终降解产物是3-吲哚甲醇，3-吲哚乙腈和3，3-二吲哚甲烷[23]。如图5所示，“紫红钻”芽苗菜的异硫氰酸酯含量明显高于“新夏50”，而“新夏50”芽苗菜中异硫氰酸酯的前体物质——硫苷的含量显著高于“紫红钻”，原因一方面是由于“紫红钻”芽苗菜的黑芥子酶活力更高；另一方面可能是“新夏50”芽苗菜中上皮硫特异蛋白的活性更高，因为上皮硫特异蛋白的存在使硫苷向腈类物质方向水解，从而降低异硫氰酸酯的形成[24]。Zhuang等[11]研究表明蓝光主要通过调控硫苷降解途径从而提高西兰花芽苗菜中萝卜硫素形成。本研究中，与对照相比，蓝光处理显著提高甘蓝芽苗菜中异硫氰酸酯的形成（p＜0.05），两种芽苗菜均在光周期8 h/d时异硫氰酸酯含量最高，分别是对照处理的1.51倍和1.41倍，与硫苷变化趋势不同，表明蓝光光周期也调控了硫苷的降解途径，但机理有待进一步研究。

3 结论

本研究发现蓝光虽然抑制甘蓝芽苗菜的生长，但活性物质抗坏血酸、花色苷、硫代葡萄糖苷和异硫氰酸酯含量明显提高。随着蓝光光周期增加，抗坏血酸含量先增加后降低，2种芽苗菜在光周期为12 h/d～20 h/d，抗坏血酸含量相对较高。花色苷含量随着光周期增加先增加并逐渐趋于平缓，“紫红钻”芽苗菜显著高于“新夏50”芽苗菜。2种甘蓝芽苗菜中硫代葡萄糖苷含量均在光周期12 h/d～16 h/d达到最高。虽然“新夏50”芽苗菜中硫苷含量明显高于“紫红钻”芽苗菜，但异硫氰酸酯相反，“紫红钻”芽苗菜中异硫氰酸酯明显高于“新夏50”，且均在蓝光光周期8 h/d时相对较高。综合考虑，蓝光光周期12 h/d～16 h/d更适合甘蓝芽苗菜的培育，且“紫红钻”芽苗菜比“新夏50”营养价值更高。本研究为蓝光在甘蓝芽苗菜的工业化生产提供理论支撑，为我国甘蓝芽苗菜产业化发展提供科学依据。