MDM2及P53在甲状腺滤泡癌中的表达及与甲状腺滤泡癌发生、发展的相关性

任鲁宁 王欢 朱占胜 霍建平 刘克毅 郑通 柴芳

(锦州医科大学附属第一医院甲状腺外科，辽宁 锦州 121012)

甲状腺滤泡癌(FTC)是常见的内分泌肿瘤之一，其在甲状腺癌中的占比约10%，恶性程度较高〔1〕。近年来，滤泡性甲状腺癌的性别差距正在缩小且变得更具侵略性〔2〕。目前主要的术前诊断方法为超声及细针穿刺细胞学检查，但都存在局限性〔3〕。故寻找甲状腺滤泡癌新的诊断方法及治疗靶点成为国内外学者的研究热点。鼠双微蛋白(MDM)2是一种E3连接酶，能针对各种基物进行泛素化反应，对肿瘤细胞的增殖有积极作用〔4～6〕。P53是肿瘤抑制因子，其突变体对肿瘤的增殖、侵袭、迁移都有积极作用。本实验通过检测P53蛋白及MDM2蛋白在FTC中的表达情况，分析二者与临床病理特征之间的相关性。

1 资料与方法

1.1资料 选择2004～2020年锦州医科大学附属第一医院收治并进行手术治疗，经病理学检查确诊为 FTC患者56例。年龄42～72岁。纳入标准：①所有样本由两位高年资病理科医师进行诊断；②所有患者术前未行内分泌及放化疗治疗；③按照 2017 年美国癌症联合会标准进行临床分期。排除标准：①合并桥本病等甲状腺疾病；②有甲状腺癌家族遗传史；③合并甲状腺桥本病或其他甲状腺疾病。本实验经本院伦理委员会同意。

1.2主要试剂 兔抗人MDM2(WL01906，Wanleibio，中国)、兔抗人P53(WL01919，Wanleibio，中国)、辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗兔IgG(111-035-003，Jackson ImmunoResearch，美国)、二氨基联苯胺(DAB，DAB-1031，迈新试剂，中国)。

1.3实验方法 采用免疫组织化学染色法，经10%甲醛固定后行脱水，包埋，切片，厚度为4 μm。检测MDM2蛋白和P53蛋白表达情况。一抗及二抗按照1∶200比例进行稀释，按照说明添加修复液进行微波修复，行过氧化氢孵育及血清封闭。依次加入一抗、二抗进行孵育，行DAB显色，苏木素复染及乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。阴性对照采用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。

1.4结果判定 由医院病理科两名高年资病理科医生采用双盲方法进行判定，根据阳性细胞的染色程度及阳性细胞所占比例进行判定。阳性细胞染色程度可分成3类：0分为无明显染色即为阴性，1分为胞核或胞质呈现淡黄色染色为弱阳性，2分为胞核或胞质呈现棕黄色染色为阳性，3分为胞核或胞质呈现黄褐色或黑色染色为强阳性。阳性细胞所占比可分为5类，0分为阳性细胞所占比例<5%，1分为6%～25%，2分为26%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%。将染色程度评分与染色占比评分进行相乘，0～3分为阴性，4～12分为阳性(其中4～6分为中表达，7～9分为中表达，10～12分为高表达)。

1.5统计学方法 采用SPSS25.0软件进行χ2检验、Fisher确切概率法及Spearman等级相关分析。

2 结 果

2.1FTC各临床参数与MDM2及P53蛋白阳性率的关系 MDM2及P53蛋白阳性率与年龄、性别和是否远处转移无统计学意义(P>0.05)，MDM2蛋白与P53在临床肿瘤分期组及MDM2在肿瘤直径组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2FTC和癌旁组织中MDM2和P53的表达情况 FTC组织和癌旁组织MDM2阳性率〔36例(64.29%)、23例(41.07%)；χ2=6.053,P=0.014〕及P53阳性率〔29例(51.79%)、18例(32.14%)〕差异有统计学意义(χ2=4.436，P=0.035)，见图1。

2.3FTC中MDM2与P53表达的相关性 在FTC组中MDM2与P53共同表达阳性21例，阴性12例。MDM2表达阳性而P53阴性15例，P53表达阳性而MDM2阴性8例。两者在FTC中呈正相关(rs=0.304，P=0.023)。

表1 FTC各临床参数与MDM2及P53蛋白阳性率的关系〔n(%)〕

图1 MDM2、P53在FTC、癌旁组织中的表达情况(免疫组化，×400)

3 讨 论

MDM2基因也被称为HDM2基因。作为E3连接酶的一种，其针对各种基物进行单基和聚泛素化，与P53肿瘤抑制因子相互作用，并建立了一个负反馈机制。P53和MDM2之间的平衡决定了细胞的生存率或肿瘤的发生〔4，5〕。 MDM2还通过激活野生型P53基因在肿瘤中的“休眠”，促使肿瘤细胞进行进一步的生长繁殖〔6〕。此外，MDM2能独立于P53促进细胞增殖，目前已在脂肪肉瘤中被用做癌症诊断生物标志物〔7〕。 Wade等〔8〕发现在EB病毒(EBV)感染的B细胞中，MDM2水平明显高于正常细胞。 近年研究发现MDM2在乳腺癌、胃癌、骨肉瘤的表达增高〔9～11〕。本研究结果推测MDM2介导的泛素化途径可能参与了FTC的发生发展，与之前的研究结果相符〔12〕，本研究结果反映了MDM2对肿瘤恶性程度的预测，虽然在本实验中MDM2的表达情况与远处转移没有相关性，但此结果可能与实验样本量相关，还有待进行进一步的验证。

P53基因是目前广泛研究的肿瘤抑制因子，P53突变体对肿瘤增殖、存活、无限复制、迁移、侵袭和转移等都起到积极作用〔13〕。近些年研究发现突变体P53的过表达对于结直肠癌干细胞的启动很重要，其引起的大肠癌细胞Wnt和核转录因子(NF)-κB通路同时过度激活，是结直肠癌发生的重要致癌机制之一〔14〕。有研究发现85%的胶质母细胞瘤患者的发病与P53-ARF-MDM2通路被下调有关〔15〕。另外P53突变体不仅与各种肿瘤细胞的启动过程有关，在转移和侵袭的过程中也起到积极作用，Ahn等〔16〕发现突变体P53-R248能诱导卵巢癌细胞迁移和侵袭。Ghatak等〔17〕发现P53突变体通过促进NF-κB和抑制ASK1/c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号传导来改变肿瘤坏死因子(TNF)-α下游信号传导，利用免疫系统的炎症作用促进肿瘤发展；且P53功能受损是由控制其水平的蛋白质MDM2的过表达引起的。本研究结果与往期的研究结果一致，笔者推测P53参与了FTC的发生发展〔18〕。有学者发现未分化型甲状腺癌与P53-MDM2-P21WAF/CIP1通路有关，且通过其表达情况可以预测甲状腺癌的恶性程度〔17〕。Swierniak等〔19〕研究中指出FTC的发生发展可能与P53-MDM2-CHEK2通路有关，笔者认为FTC的发生发展可能与P53和MDM2的过表达有关，且两者在一条通路上。但对于二者在FTC中的作用机制仍存在争议，还有待更多的实验进行验证〔12,19〕。MDM2催化不同底物形成的泛素化底物，一方面特异性抑制P53转录，引起P53的堆积，另一方面MDM2本身的过表达也会引起基因组的不稳定，最终导致FTC发生，并在其病情发展的过程中也起到一定积极作用。目前泛素化相关蛋白在甲状腺癌领域研究较少，还需要更多研究来进行验证。

综上，MDM2与P53蛋白的聚集可能与FTC的发生发展密切相关，抑制MDM2和P53的聚集，可能会成为FTC新的治疗靶点，但二者作用的具体机制有待进一步研究证实。