沙库巴曲缬沙坦钠片通过NF2/Mst1信号通路抑制细胞凋亡改善心肌梗死大鼠心肌纤维化

向长铁 刘佳丽 张爱民 吴倩 聂连桂 刘茂军 杨军

(1南华大学附属第一医院心内科，湖南 衡阳 421001；2常德市石门县人民医院)

冠状动脉粥样硬化性心脏病是导致人类疾病死亡的主要原因之一，据推算我国现有冠心病患者1 100万〔1〕。而心肌梗死为导致死亡及不良预后的最常见的原因，尤其心肌梗死后往往出现明显的心功能不全，故严重影响了心肌梗死的长期预后，而心肌重构是其发生发展的关键环节。心肌梗死后心肌细胞可出现细胞凋亡、坏死，正常心肌细胞数量减少，间质胶原纤维增多，导致心肌负性重构。现有研究表明细胞凋亡是心肌梗死后心肌重构的重要机制〔2〕。而神经纤维蛋白(NF)2/哺乳动物不育系20样激酶(Mst)1信号通路在多项研究中已被证实可以促进心肌细胞凋亡〔3～6〕，Dalal等〔4〕研究显示，在心肌梗死大鼠模型中，异丙肾上腺素(Iso)可翻译修饰NF2激活Hippo信号通路通过线粒体死亡途径参与心肌细胞凋亡，相反NF2/Mst1活化受阻，则抑制细胞凋亡。 沙库巴曲缬沙坦钠片(诺欣妥，Lcz696)是由脑啡肽酶抑制剂沙库巴曲和血管紧张素受体抑制剂缬沙坦(Vdt)组成一种抗心力衰竭药物，目前已有多项研究证明，诺欣妥具有心血管保护和抗心肌重构作用〔7～9〕。研究证实，Lcz696可以通过抑制促炎性细胞因子、基质金属蛋白酶(MMP)9及醛固酮的生成等在心肌梗死中发挥心肌保护作用〔9〕。但其否通过MF2/Mst1信号通路抑制细胞凋亡保改善梗死后心肌纤维化目前尚不清楚。本实验通过建立异丙肾上腺素致大鼠心肌梗死模型，研究Lcz696能否通过NF2/Mst1信号通路抑制细胞凋亡改善心肌梗死后心肌纤维化。

1 材料与方法

1.1材料 40只雄性SD大鼠，体重(220±20)g，于南华大学动物实验中心处购买，保证水源和食物充足，在室温(23±1)℃下分笼喂养，昼夜更替为12 h，适应性喂养1 w。

1.2主要试验试剂 Iso(大连美仑公司)；Lcz696(瑞士Novartis Pharma Schweiz AG公司)；Vdt(海南皇隆制药股份有限公司)；NF2、Mst1等一抗(美国Proteinch公司)；一抗甘油醛-3磷酸脱氢酶(GAPDH，晶欣生物公司)；羊抗兔二抗(武汉博士德公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒及细胞裂解液(碧云天公司)。

1.3动物模型的建立及分组 大鼠经适应性喂养1 w后，随机分成4组，对照组(Control组)、模型组(Iso组)、Lcz696干预组(Iso+Lcz696组)和Vdt干预组(Iso+Vdt组)，后3组经腹腔注射Iso〔50 mg/(kg·d)〕共2次，Control组同时腹腔注射等量生理盐水2次，通过检测心电图和肌钙蛋白确定模型建立成功，然后Iso+Lcz696组每日分别予以Lcz696(60 mg/kg)灌胃，Iso+Vdt组每日分别予以Vdt(30 mg/kg)灌胃，Control组和Iso组每日分别予以等量的蒸馏水灌胃。共干预4 w。

1.4Masson染色观察各组心肌胶原沉积 取出甲醛浸泡的心脏组织，过氧化氢冲洗，乙醇脱水，石蜡包埋后，再使用刀片切取4 μm左右组织，脱蜡直至水化，再使用苏木素染色8～10 min，冲洗，再通过1%盐酸-酒精分色，冲洗，接着采用丽春红酸性品红液染色5～10 min，冲洗，予1%磷钼酸水溶液处理5 min后再经苯胺蓝液染色5 min，然后置于1%冰醋酸中浸泡1 min，最后再次予以梯度酒精脱水，透明，置于光镜下观察。

1.5Western印迹检测相关蛋白表达 取各组大鼠左心室组织样本，研磨均匀后加入细胞裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液后裂解10 min，离心提取上清液，通过BCA比色法进行蛋白定量，然后再通过制胶、电泳、转膜和封闭后，用稀释好的GAPDH、NF2、Mst1、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、半胱天冬酶(Caspase)9的一抗在4℃下孵育24 h，TBST溶液漂洗3次后，再用稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗在37℃下孵育1 h，TBST漂洗3次，避光下在装有BIO-ID的显影仪器上显影，经图像分析后，获取目的条带，通过与GAPDH的灰度对比来表示蛋白表达水平。

1.6统计学方法 采用SPSS18.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组大鼠存活情况 干预结束后存活大鼠36只，Control组10只，Iso组9只，Iso+Lcz696组9只，Iso+Vdt组8只。大鼠死亡原因与心肌梗死后心肌损伤或心力衰竭有关。

2.2各组大鼠心电图分析 建模后检测各组大鼠心电图变化，Iso组、Iso+Lcz696组和Iso+Vdt组大鼠建模成功后心电图对比Control组，Ⅱ导联T波高耸，ST段呈弓背向上抬高。见图1。

2.3各组大鼠血浆肌钙蛋白检测 建模后检测抽取的尾部静脉血，检测各组大鼠肌钙蛋白值变化，Control组、Iso组、Iso+Lcz696组和Iso+Vdt组大鼠血浆肌钙蛋白水平分别为：(30.17±6.99)pg/ml、(376.12±49.72)pg/ml、(385.22±61.99)pg/ml、(383.54±41.36)pg/ml，Iso组、Iso+Lcz696组和Iso+Vdt组血浆肌钙蛋白水平与Control组相比均有明显升高(P<0.05)。

2.4各组大鼠心肌组织Masson染色结果 Masson染色观察心肌组织胶原沉积，沉积胶原纤维为蓝染。与Control组相比，Iso组蓝色区域明显增多，胶原纤维沉积明显。与Iso组相比，Iso+Lcz696组蓝色区域显著减少，胶原纤维沉积显著减少。而Iso+Lcz696组与Iso+Vdt组相比，心肌胶原纤维沉积显著减少。见表1、图2。

图1 各组大鼠心电图结果

表1 各组胶原纤维占比及Caspase9、Bcl-2、NF2、Mst1蛋白表达水平比较

图2 各组心肌组织Masson染色(×400)

2.5各组心肌组织Caspase9、Bcl-2、NF2和Mst1等蛋白表达 与Control组相比，Iso组心肌组织中Caspase9蛋白表达显著上调(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表达显著下调(P<0.05)。与Iso组相比，Iso+Lcz696组和Iso+Vdt组大鼠心肌组织中Caspase9表达显著下调(P<0.05)，而Iso+Lcz696组Bcl-2的蛋白表达显著上调(P<0.05)，Iso+Vdt组Bcl-2表达则上调不明显(P>0.05)。同时与Control组相比，Iso组心肌组织中NF2、Mst1的蛋白表达显著上调(P<0.05)。与Iso组相比，Iso+Lcz696组和Iso+Vdt组NF2、Mst1的蛋白表达显著下调(P<0.05)，但Iso+Lcz696组与Iso+Vdt组相比NF2、Mst1的蛋白下调更明显(P<0.05)。见表1、图3。

图3 各组大鼠心肌组织Caspase9、Bcl-2、NF2、Mst1蛋白表达结果比较

3 讨 论

心肌梗死后出现的心肌重构是决定患者长期预后的关键环节〔10〕，而心肌细胞凋亡则是其中的重要病理机制〔11〕。本实验通过以腹腔注射Iso 2 d建立大鼠心肌梗死模型〔12～14〕。建模后对照组及干预组心电图T波高耸，ST段成弓背上抬，肌钙蛋白较正常组明显升高。确定模型建立成功。同时Masson染色显示心肌梗死大鼠存在明显心肌纤维化，Iso组大鼠心肌组织Caspase9明显上调，而Bcl-2的表达下调，提示心肌梗死后心肌重构可能与心肌细胞凋亡增加有关。

NF2是埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ezrin/radixin/moesin，ERM)家族的成员，一种促凋亡激酶，能够调节细胞胞内和胞外信号传递。Mst1是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，在心肌损伤中易被激活〔5〕。NF2/Mst1信号通路在心肌细胞更新和心脏修复作用中起着重要作用〔4〕。有研究表明，在心肌缺血再灌注损伤模型中，NF2激活磷酸化后，可激活Mst1，促进心肌细胞凋亡〔15〕。另有研究显示，Iso可诱导NF2/Mst1的表达增加，NF2/Mst1的失活可增加心肌梗死后心肌细胞数量，减少瘢痕形成，改善心功能，而NF2/Mst1上调可通过线粒体死亡途径，促进心肌细胞凋亡〔4〕。本研究提示，NF2/Mst1激活诱发的细胞凋亡可能参与心肌梗死后心肌重构发生机制。

诺欣妥是近年来在心力衰竭治疗领域广泛应用的新药，已有研究显示Lcz969可通过抑制鸟嘌呤核苷酸结合蛋白改善心脏重构〔4〕。另有研究显示，Lcz696通过降低糖尿病小鼠心肌纤维化改善心脏功能，可能与沙库巴曲的作用有关〔16～20〕。Lcz696可以减轻心肌梗死后心肌纤维化，原因可能是由沙库巴曲和Vdt共同作用所致〔5〕。本研究提示Lcz696可能通过NF2/Mst1信号通路通过抑制心肌细胞凋亡来改善心肌梗死后大鼠心肌纤维化；Lcz696改善心肌重构的作用可能沙库巴曲和Vdt共同作用所致，其抑制心肌梗死后心肌纤维化的作用可能与抑制NF2/Mst1介导的细胞凋亡有关。以上研究为进一步探讨梗死后心肌重构发生机制及干预策略提供了初步的实验依据。