miR-29a调控Wnt/β-catenin信号改善癫痫大鼠学习记忆能力并减少神经细胞凋亡的机制

吴琳 邱建维 黄灵芝

(浙江特殊教育职业学院，浙江 杭州 310023)

癫痫是病理生理学中极为常见的神经系统疾病，其发病原因复杂，部分癫痫患者不能有效控制，可发展为难治性典型，另外，癫痫的发作还能够诱导认知功能障碍、视物能力障碍及情绪障碍等一系列问题〔1〕。miRNA是一类具有广泛作用的非编码RNA，参与调控疾病、正常生理过程〔2〕。癫痫的发生与miRNA的异常表达具有密切关系，已有多种miRNA被证实可能参与癫痫进展〔3〕。有报道表明〔4，5〕，miR-29a在神经损伤中发挥保护作用。目前尚不清楚miR-29a在癫痫中的作用及机制。本研究旨在探讨miR-29a调控Wnt/β-catenin信号对癫痫大鼠学习记忆能力和神经细胞凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 SD大鼠，雌雄各半，6～8周龄，体重180～220 g，购自浙江省医学科学院，许可证号：SCXK(浙)2019-0002。原位末端标记(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒由碧云天生物技术研究所生产；兔抗c-Myc抗体由美国Cell Signaling Technology公司生产；丙二醛(MDA)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒由北京索莱宝科技有限公司生产；兔抗β-catenin抗体由美国Santa Cruz Biotechnology公司生产；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒由南京建成生物工程研究所有限公司生产；兔抗Bax抗体由美国GeneTex公司生产；miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRNA荧光定量检测试剂盒由赛尔瑞成(北京)生命科学技术有限公司生产；mimics control、miR-29a mimics由上海吉玛制药技术有限公司合成；兔抗B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2抗体由美国Abcam公司生产；硫酸阿托品、氯化锂、Wnt/β-catenin激活剂SB216763由上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产；匹罗卡品(毛果芸香碱)，规格：100mg，纯度≥98%，由北京沃凯生物科技有限公司生产。

1.2模型构建〔5〕大鼠经过适应性饲养后，按照氯化锂-匹罗卡品方法构建癫痫大鼠模型。步骤为：首先腹腔注射3 mmol/kg氯化锂，18 h后，继续腹腔注射1 mg/kg硫酸阿托品，30 min后，再次注射35 mg/kg匹罗卡品。然后按照Racine分级方法测定癫痫发作的级别，大鼠癫痫发作级别达到Ⅳ级后，视为造模成功。癫痫发作后，大鼠恢复状态良好时进行实验。Racine分级标准见文献〔5〕。

1.3实验分组处理 48只癫痫大鼠随机分成模型组、miR-NC组、miR-29a组、miR-29a+SB216763组，每组12只，选择12只正常大鼠作为对照组。miR-NC、miR-29a组分别在造模成功后大鼠状态良好时脑侧室注射10 μl mimics control(10 mg/kg)、miR-29a mimics(10 mg/kg)〔6〕，miR-29a+SB216763组在造模成功后在大鼠状态良好时脑侧室注射10 μl miR-29a mimics(10 mg/kg)和10 μl Wnt/β-catenin激活剂SB216763(0.1 g/μl)〔7〕，连续注射7 d。模型组和对照组大鼠注射等量的生理盐水。从第8天开始进行水迷宫训练，空间探索检测后，水合氯醛麻醉大鼠，取大鼠海马神经组织，用于实验指标检测。

1.4qRT-PCR方法检测miR-29a表达 取大鼠海马神经组织，添加Trizol试剂提取总RNA。以miRNA cDNA第一链合成试剂盒进行反转录，以miRNA荧光定量检测试剂盒对miR-29a表达进行半定量分析。内参设置为U6，计算方法为2-△△Ct法。引物序列〔8〕为miR-29a上游：TAGCACCATTTGAAATCAGTTT，下游:TGCGTGTCGTGGAGTC；U6上游:CTCGCTTCGGCAGCACATA，下游：GTGCAGGGTCCGAGGT。

1.5Western印迹检测β-catenin、c-Myc、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Bcl-2蛋白表达 取大鼠海马神经组织，按照每50 mg组织中添加100 μl的裂解液提取总蛋白。参照二喹啉甲酸(BCA)方法检测蛋白浓度，配制10%分离胶、5%浓缩胶，每个样品孔内添加30 μg蛋白，先以80 V电压电泳0.5 h，然后以100 V电压电泳2 h。100 V电压转膜80 min。聚偏氯乙烯(PVDF)膜置于5%脱脂奶粉内，室温、摇床孵育2 h。将PVDF膜放在稀释后的一抗、二抗内，在室温中结合2 h。β-catenin、Bax、Bcl-2一抗以1∶1 000稀释，c-Myc一抗以1∶800稀释。二抗以1∶2 000稀释。电化学发光(ECL)方法显色。以Image J分析条带的灰度值。GAPDH为参照，分析目的蛋白表达变化。

1.6水迷宫实验检测学习记忆能力 用Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力。圆形水池分成4个象限，分别为W、E、N、S，在每个象限选取一个固定的入水点。将白色平台固定于N象限中部位置，在水池中注水，水温为22℃，添加二氧化钛，充分搅拌，此时水池不透明。大鼠每天训练2次，训练4 d，大鼠头部面向池壁放入水中，当大鼠游到平台时，保持大鼠在平台上逗留30 s，如果120 s大鼠仍然没有找到平台，则由实验者将大鼠引导平台。第5天时，记录大鼠从入水到平台的时间，即逃避潜伏期。第6天时进行空间探索实验，将平台撤掉，记录大鼠在120 s内穿过平台位置的次数，记录大鼠在原平台所在象限停留时间。

1.7TUENL法检测细胞凋亡 取大鼠海马神经组织，经4%多聚甲醛固定后，用浓度梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋、切片，切片厚度为4 μm，在45℃的烘箱中烤干。二甲苯脱蜡，浓度梯度酒精水合，用0.1% Triton X-100通透，3%过氧化氢封闭，滴加TdT反应液，添加Streptavidin-HRP溶液，加上盖玻片，避光反应30 min。DAPI染色，封片，在激光共聚焦显微镜下观察细胞凋亡指数。凋亡指数=(凋亡数目÷细胞总数)×100%。

1.8SOD、MDA、GSH-Px检测 取大鼠海马神经组织，以SOD检测试剂盒(可见分光光度法)、MDA检测试剂盒(可见分光光度法)、GSH-Px检测试剂盒(比色法)测定SOD、MDA、GSH-Px含量，步骤完全根据试剂盒说明书操作。

1.9统计学分析 采用SPSS25.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组β-catenin、c-Myc、miR-29a表达比较 与对照组比较，模型组海马神经组织β-catenin、c-Myc蛋白表达量升高，miR-29a表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与miR-NC组比较，miR-29a组β-catenin、c-Myc蛋白表达量降低，miR-29a表达量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与miR-29a组比较，miR-29a+SB216763组β-catenin、c-Myc蛋白表达量显著升高(P<0.05)。 见图1，表1。

1～5:对照组、模型组、miR-NC组、miR-29a组、miR-29a+SB216763组；下图同图1 Western印迹方法检测大鼠海马神经组织中Wnt/β-catenin信号相关蛋白表达

表1 各组大鼠海马神经组织中β-catenin、c-Myc蛋白表达量和miR-29a表达量比较

2.2各组逃避潜伏期、穿越平台次数、平台家限停留时间比较 与对照组比较，模型组逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少，平台象限停留时间缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。与miR-NC组比较，miR-29a组逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多，平台象限停留时间延长，差异有统计学意义(P<0.05)。与miR-29a组比较，miR-29a+SB216763组逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少，平台象限停留时间缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。 见表2。

表2 各组逃避潜伏期、穿越平台次数、平台象限停留时间比较

2.3各组海马神经细胞凋亡指数比较 与对照组〔(10.12±1.25)%〕比较，模型组海马神经细胞凋亡指数〔(24.78±2.69)%〕显著升高(P<0.05)；与miR-NC组〔(23.84±2.95)%〕比较，miR-29a组〔(15.02±1.64)%〕显著降低(P<0.05)；与miR-29a组比较，miR-29a+SB216763组〔(20.17±1.53)%〕显著升高(P<0.05)。

2.4各组神经组织中Bax、Bcl-2蛋白表达比较 与对照组比较，模型组海马神经组织中Bax蛋白量升高，Bcl-2蛋白表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与miR-NC组比较，miR-29a组海马神经组织中Bax蛋白量降低，Bcl-2蛋白表达量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与miR-29a组比较，miR-29a+SB216763组海马神经组织中Bax蛋白量升高，Bcl-2蛋白表达量降低(P<0.05)。 见图2，表3。

图2 Western印迹方法检测大鼠海马神经组织中Bax、Bcl-2蛋白表达

表3 各组大鼠海马神经组织中Bax、Bcl-2蛋白表达量比较

2.5各组海马神经组织中SOD、MDA、GSH-Px含量比较 与对照组比较，模型组海马神经组织中MDA含量升高，SOD、GSH-Px含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与miR-NC组比较，miR-29a组海马神经组织MDA含量降低，SOD、GSH-Px含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与miR-29a组比较，miR-29a+SB216763组海马神经组织MDA含量升高，SOD、GSH-Px含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。 见表4。

表4 各组海马神经组织中SOD、MDA、GSH-Px含量比较

3 讨 论

癫痫作为常见疾病，其发生机制十分复杂，包括神经细胞凋亡、氧化应激等〔9〕。很多癫痫患者表现为认知和学习记忆能力下降，与神经损伤密切相关〔10〕。癫痫病理条件下，神经组织中产生大量的氧自由基，这些氧自由基的积累与抗氧化酶SOD、GSH-Px活性降低有关，过量的氧自由基不仅可以诱导脂质发生过氧化，造成细胞损伤，还可以激活细胞凋亡途径，诱导细胞凋亡发生〔11,12〕。MDA是脂质发生过氧化后的产物，其含量升高标志细胞氧化应激水平增加〔13〕。Bax和Bcl-2均为Bcl-2蛋白家族成员，在细胞凋亡过程中发挥促进和抑制作用〔14〕。miRNA是近些年来分子生物学研究的热点领域，其在细胞分化、凋亡等过程中发挥作用，且还与很多疾病的发生有关〔15〕。miR-29a在神经损伤中发挥保护作用，miR-29a对缺氧诱导的新生鼠神经损伤有改善作用〔16〕，miR-29a还可促进神经细胞分化、延长轴突〔4〕。本研究结果说明miR-29a可促进癫痫大鼠学习记忆能力恢复，减少细胞凋亡和氧化应激，miR-29a在癫痫中发挥抑制功效。

本文还进一步研究了miR-29a的作用机制，发现过表达miR-29a能够降低癫痫大鼠海马神经组织中β-catenin、c-Myc蛋白表达量，miR-29a作用机制可能与Wnt/β-catenin信号有关。β-catenin是Wnt/β-catenin信号的关键蛋白，其表达增多后可诱导下游靶基因c-Myc的表达〔17〕。Wnt/β-catenin信号是经典的Wnt信号，其有多种生物学作用，与疾病的进展有关〔18〕。Wnt/β-catenin信号在癫痫中发挥促进作用，过度激活Wnt/β-catenin可增加癫痫发病风险〔19～21〕。本研究结果发现Wnt/β-catenin信号激活剂可部分逆转过表达miR-29a对癫痫大鼠学习记忆能力和神经细胞凋亡、氧化应激的作用，提示miR-29a能够通过调节Wnt/β-catenin信号影响癫痫大鼠学习记忆能力和神经细胞凋亡。

综上，miR-29a在癫痫中发挥抑制功效，其可通过抑制Wnt/β-catenin信号改善癫痫大鼠学习记忆能力，减少细胞凋亡，这为阐明癫痫分子发生机制奠定了基础。