猪肉中4种硝基呋喃类药物的纳米纤维固相萃取快速前处理及检测方法的建立

陈雅南，卫兰兰，，邵栋梁，王 迪，杨燕燕，朱帅杰，李景军*，

(1．安徽科技学院 食品工程学院，安徽 滁州239000；2．安徽国科检测科技有限公司，安徽 合肥230000)

0 引言

硝基呋喃类药物是一类人工合成的抗生素，主要通过微生物酶系统，抑制乙酰辅酶A，干扰微生物糖类的代谢，从而起抑菌作用[1]．这类药物主要包括呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮，如图1所示．硝基呋喃类药物因为价格便宜，而且效果显著，而广泛应用于畜禽及水产养殖业，以治疗由大肠杆菌或沙门氏菌引起的肠炎、疥疮、赤鳍病等[2]．随着硝基呋喃类药物使用量的增加，这类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎的副作用也越来越显著[3]．因此，2010年3月22日，呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮被中国卫生部列入可能违法添加的非食用物质黑名单[4-5]．

图1 四种硝基呋喃类药物的分子结构式

近年来，国内外对动物源性食品中兽药残留检测的报道有很多．其检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[6]、液质联用法(LC-MS)[7]、超高效液相色谱法(UPLC)[8]和酶联免疫吸附试验法(ELISA)[9]等，这些方法存在使用成本高；普及率低，且对样品前处理要求苛刻；存在交叉反应、容易出现假阳性等问题．动物源性食品基质复杂，目标物质含量极低，必须对样品进行预处理才能进行检测分析．纳米纤维固相萃取(Packed-fiber Solid-phase Extraction，PFSPE)是一项能够解决样品基质复杂的前处理技术，现在也是分析化学的发展前沿和热点．PFSPE是一种样品前处理方法，由液-固萃取柱和色谱技术相结合发展而来，主要用于样品分离、纯化和浓缩，回收率高，能有效将目标物与干扰物质分离，操作简便且省时省力．因为聚吡咯易于合成且具有良好的稳定性，所以在商业领域研究非常有前景．

本实验基于功能性纳米纤维研究利用高效液相色谱-紫外法对猪肉中4种硝基呋喃类药物进行检测，建立了简便低耗且高效的检测方法．该实验采用纳米纤维固相萃取样品前处理技术，此方法不仅操作简便高效，而且萃取柱的纤维填充量为几微克，实用性强，为动物源性食品中兽药残留的分离检测提供新的思路和途径．

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

新鲜猪肉：凤阳农贸市场购买；聚吡咯纳米纤维：苏州东奇生物科技有限公司提供．

乙酸铵：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；甲醇：色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化钠：分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；N，N-二甲基甲酰胺：99%生物技术级，上海麦克林生化科技有限公司；浓硫酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司．

硝基呋喃类标准品：呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮，纯度均≥98%，上海贤鼎生物科技有限公司．

1．2 实验仪器

日本岛津LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司；KQ3200E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Vortex-M旋涡混匀仪，上海沪析实业有限公司；DHG-9030A电热恒温鼓风干燥箱，上海三发科学仪器有限公司；梅特勒XS105DU型电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；FD．JH．JS 1000 mL超滤装置、AP-01P真空泵，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；TGL-16台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司．

1．3 实验方法

1．3．1 标准溶液的制备

(1)单标标准溶液的制备(1．0 mg/mL)

分别精确称取4种硝基呋喃类药物各10．0 mg(精确到0．01 mg)于10 mL容量瓶，用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解并用甲醇定容至刻度线处，4 ℃避光保存1个月．

(2)混标标准溶液1的制备(0．025 mg/mL)

先将4个单标标准溶液(1．0 mg/mL)用蒸馏水稀释10倍，得到溶液浓度为0．1 mg/mL；再各取1 mL 0．1 mg/mL 4个单标标准溶液混合均匀，此时得到混标标准溶液1的浓度为0．025 mg/mL，4 ℃避光保存1个月．

(3)混标标准溶液2的制备(以SEM浓度标记)

精确称取AHD、AOZ、AMOZ各10．0 mg(精确到0．01 mg)，SEM为0．5 mg(精确到0．01 mg)，分别于4个10 mL容量瓶中，用DMF溶解并用甲醇定容至刻度线处，此时AHD、AOZ、AMOZ浓度为1 mg/mL，SEM浓度为0．05 mg/mL．再各取1 mL混合均匀，此时得到混标标准溶液2的浓度为0．012 5 mg/mL(以SEM浓度标记)，4 ℃避光保存1个月．

1．3．2 纳米纤维固相萃取柱的制备

纳米纤维固相萃取柱和聚吡咯(PPy)纳米纤维均购自苏州东奇生物科技有限公司(如图2所示)．称取PPy纳米纤维4．0 mg分次装于萃取柱中，用直径为0．5 mm的不锈钢细棒压实，即纳米纤维固相萃取柱制备完成．需注意在使用纳米纤维固相萃取柱之前，应先活化PPy纳米纤维，即用200 μL甲醇洗涤后，再加入200 μL蒸馏水完成活化．

1．3．3 样品前处理和萃取

新鲜猪肉购自当地农贸市场．称取2．0 g(精确至0．01 g)试样于50 mL塑料离心管中，加入20 mL 90%甲醇水，用匀浆机将其粉碎均匀1 min；混匀后超声30 min，9 000 r/min冷冻离心10 min，移取其全部上清液，4 ℃保存备用．

图2 PFSPE萃取柱装置

先将待测样柱上液移500 μL至纳米纤维固相萃取柱中，再手动操作纳米纤维固相萃取柱，利用空气加压，使待测样缓慢流过纳米纤维，然后液滴逐滴被压出，1滴/秒的流速最合适[10]；然后再用100 μL洗脱剂把目标物从吸附剂上洗脱下来；洗脱后，将收集的洗脱液涡旋混匀1 min；最后，取一定量洗脱液进行高效液相色谱检测分析，萃取装置见图2．特别注意的是在整个萃取的过程中，需仔细控制待测样品以缓慢且均匀的流速流过PFSPE萃取柱(流速过快，萃取不完全；流速过慢，萃取住堵塞，致使待测样品滞留在PFSPE萃取柱中)．

1．3．4 色谱条件

色谱柱：紫外检测器(UV)，C18柱，柱150 nm，内径4．6 nm；流动相：A：纯甲醇，B：0．1%乙酸铵(梯度洗脱)见表1；流速：1．0 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积：10．0 μL；检测波长：365 nm；运行时间：30 min(目标物保留时间)见表2．

表1 UPLC-UV流动相梯度洗脱程序

表2 硝基呋喃类药物目标物保留时间

1．3．5 洗脱率计算

以0．025 mg/mL混标标准溶液1为柱上液，取其500 μL过纳米纤维固相萃取柱，过柱后，移取适量的洗脱液对目标物进行洗脱，洗脱液混匀，洗脱液全部装进自动进样瓶中，供HPLC检测分析，进样体积为10 μL，记录峰面积为Ai，同时以硝基呋喃类药物0．025 mg/mL的柱上液，即混标标准溶液直接进样分析的色谱峰面积记为As，以该公式(1)计算各纳米纤维固相萃取条件下硝基呋喃类药物的洗脱率，重复操作3次，计算其平均值，即最终洗脱率(%)[11]．

洗脱液=(Ai/5)/As

(1)

1．4 数据处理

本实验所有液相数据采用Origin2019b(美国OriginLab公司)和Excel2019(美国Microsoft微软公司)进行统计分析．

2 结果与分析

2．1 纳米纤维固相萃取条件的优化

为得到最高的萃取效率，对影响PPy纳米纤维萃取效率的主要因素：洗脱液的体积、洗脱液中硫酸的含量、纤维填充物的用量、柱子重复使用次数、盐浓度对吸附条件的影响进行优化实验．以0．025 mg/mL混标标准溶液1稀释25倍，即0．001 mg/mL为柱上液，以洗脱率作为萃取效率的监测指标．

2．1．1 洗脱液体积的优化

硝基呋喃类药物是一类含氧的五元杂环，如图1所示，难溶于水，易溶于有机溶剂．实验以甲醇为流动相，由于硝基呋喃类药物易溶于甲醇，且聚吡咯纳米纤维难溶于甲醇，不会影响洗脱效果，所以实验选择用纯甲醇洗脱纳米纤维小柱上吸附的目标物．洗脱液体积分别以40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL、200 μL进行优化实验[11]．洗脱液体积与硝基呋喃类药物洗脱率的关系如图3所示．

图3 洗脱液体积对硝基呋喃类药物洗脱率的影响(n=3)

由图3可知，随着洗脱液体积的增加，洗脱率总体趋势是先增大后减小．当洗脱液的体积为100 μL时，可将纳米纤维小柱上吸附的目标物有效地洗脱，此时洗脱率最佳．继续增加洗脱液的体积，洗脱率呈现逐渐下降趋势．因此，通过实验确定洗脱液的体积为100 μL．

2．1．2 洗脱液中硫酸含量的优化

实验发现，纯甲醇溶液不能将硝基呋喃类药物完全洗脱，100 μL纯甲醇的洗脱率平均仅50%左右．硝基呋喃类药物属于强极性有机物，能够与PPy纳米纤维产生强烈的相互作用，其作用可能是由于PPy本身的阴离子交换性能以及PPy与目标物之间的π-π键作用引起的．有研究发现[12-14]，甲醇比水的极性弱，但也具有羟基可以与极性目标物竞争吸附剂上吸附位点，进而将目标物从固相吸附材料上洗脱下来．对于硝基呋喃来说，纯甲醇洗脱率低，推断是其分子中含σ键与π键，在pH=7条件下以离子形式与PPy的作用很强，致使纯甲醇不能完全洗脱目标物．但其在酸性条件下能够以分子形式存在，与PPy纳米纤维相互作用反而减弱了，因此，在纯甲醇溶液中加入硫酸，补充H+，从而使PPy纳米纤维上的目标物洗脱下来．

结合实验以及参阅文献[15-16]得知，洗脱溶剂应有较强的洗脱能力，且应满足UPLC-UV检测的条件．研究不同比例的8 mol/L硫酸-甲醇混合溶液对吸附在纳米纤维上的目标物进行洗脱，并对其洗脱效率进行考察．因此，选择8 mol/L硫酸在洗脱液中含量为0%、10%、15%、20%进行优化实验．洗脱液中硫酸含量与硝基呋喃类药物洗脱率的关系如图4所示．

图4 洗脱液中硫酸含量对硝基呋喃类药物洗脱率的影响(n=3)

由图4可知，随着8 mol/L硫酸含量的增加，洗脱率先增加后减小．当8 mol/L硫酸在洗脱液中含量为15%时，洗脱率最大．当硫酸含量过大，H+补充过多，甲醇中的羟基全部转化为分子形式，致使洗脱率降低．故选择8 mol/L硫酸在洗脱液中含量为15%，即在后续实验中洗脱液为8 mol/L硫酸-甲醇(15∶85)混合溶液．

2．1．3 纤维填充物用量的优化

PPy纳米纤维的填充量也是决定能否为目标物提供充足吸附位点的一个重要因素，以实现良好的富集．一般来说，吸附剂的用量应足够大，萃取更多的目标物，为了确定纳纤维填充物的用量，对不同用量的纤维填充物进行了优化实验．本实验研究了纤维填充物用量为3～8 mg质量范围内的PPy纳米纤维对4种硝基呋喃类药物的萃取效果．纤维填充物用量与硝基呋喃类药物洗脱率的关系如图5所示．

图5 纤维填充物用量对硝基呋喃类药物洗脱率的影响(n=3)

由图5可知，当纳米纤维材料从3 mg增加到4 mg时，随着纤维填充物用量的增加，4种目标物的洗脱率也随之增加；当纤维填充物用量由5 mg增加至8 mg时，4种目标物的洗脱率随着纤维填充物用量的增加而减小．其主要原因是当纤维填充物用量逐渐增加时，柱床增大，100 μL洗脱液不能完全将目标物洗脱，导致洗脱效率降低；纤维填充物用量为7 mg和8 mg时，AHD、SEM、AOZ洗脱率急剧下降，也正说明了此原因．因此，本实验选择纳米纤维用量为4 mg，进行后续实验的纳米纤维固相萃取．

2．1．4 柱子重复使用次数

在优化的纳米纤维固相萃取条件下，对PPy纳米纤维固相萃取柱的重复利用性能进行考察[17]．在PPy纳米纤维固相萃取柱使用一次之后，用8 mol/L硫酸-甲醇(15∶85)混合溶液继续洗脱，直到洗脱液中检测不出目标物为止，实验结果显示洗涤3次之后再无目标峰出现．重复使用同一个PPy纳米纤维固相萃取柱，进行4次相同实验，考察其洗脱率的变化．柱子重复使用次数与硝基呋喃类药物洗脱率的关系如图6所示．

图6 柱子重复使用次数对硝基呋喃类药物洗脱率的影响(n=3)

由图6可知，PPy纳米纤维固相萃取柱最多重复使用2次．PPy纳米纤维固相萃取柱在重复使用2次之后，洗脱率明显下降，表明其化学和机械稳定性一般，但总体来说，其良好的重复使用性能与高效、低耗、绿色环保等特点，使其具有很好的实际应用价值．

2．1．5 盐浓度对吸附条件影响的优化

由于流动相B泵使用的是0．1%乙酸铵溶液，乙酸铵是一种有机化合物，结构简式为CH3COONH4，乙酸铵水溶液pH在7左右，显中性，属于盐类．因此，本实验研究盐浓度对吸附条件的影响．结合相关文献，认为NaCl稳定性比较好，其水溶液也呈中性，所以实验将氯化钠加入待检测样品中，研究盐浓度对目标物洗脱率的影响，分别用0．12、0．15、0．18、0．20、0．23和0．26 g/mL NaCl溶液稀释目标物混标标准溶液1至目标浓度，再进行纳米纤维固相萃取．不同盐浓度与硝基呋喃类药物洗脱率的关系如图7所示．

图7 不同盐浓度对硝基呋喃类药物洗脱率的影响(n=3)

由图7可知，随着NaCl溶液浓度的增加，洗脱率先增加后降低，呈倒“U”型．因为NaCl浓度不断增大，水溶液的粘度增大，分子间传递受阻，从而导致洗脱率降低；加入NaCl溶液浓度过高，会使目标物与吸附剂表面的相互作用减弱，洗脱率降低．因此，在本实验中研究不同盐浓度与硝基呋喃类药物洗脱率的关系时，可以适当添加NaCl溶液，实验研究表明添加的NaCl溶液最佳浓度为0．18 g/mL，目标分子的富集效果最显著．

2．2 方法学研究

首先验证了标准溶液和混合基质标准溶液的方法，并对本实验进行了方法学评价，包括线性、检出限(LOD)、定量限(LOQ)、回收率及精密度．首先要测定样品基体中4种硝基呋喃类药物的含量，作为本底值，方法学验证中均扣除了各目标物的本底值．

2．2．1 回收率与精密度

以4种硝基呋喃类药物混标标准溶液2做添加回收实验，添加浓度分别为50 ng/mL、100 ng/mL、250 ng/mL，每个浓度平行3次[18]．然后按上述方法萃取洗脱后进行HPLC检测．计算其回收率和日内(早、中、晚各测定1次)与日间(连续测定3 d)精密度．该方法的检出限与定量限用信噪比(S/N)为3和10的浓度确定，实验结果如表3所示，4种目标物的LOD和LOQ在2．26～7．18 ng/mL和7．53～23．94 ng/mL的范围；各个添加浓度的回收率范围为70．65%～84．32%；RSD日间(n=3)在5．41%～16．95%之间，RSD日间(n=3)为2．80%～14．21%，表现出良好的准确度和精密度．

表3 4种硝基呋喃类药物的线性范围、LOD、LOQ、回收率与精密度

2．2．2 加标实验的回收率与精密度

将4种硝基呋喃类药物混标标准溶液2注射到2．0 g阴性试样中，再进行样品前处理．最终定容浓度为：50 ng/mL、100 ng/mL、250 ng/mL，做这3个浓度的添加回收实验，进行方法精密度和准确度的考察．然后按上述方法萃取洗脱后进行HPLC检测．该方法的检出限与定量限用信噪比(S/N)为3和10的浓度确定，结果如表4所示，4种目标物的LOD和LOQ分别在2．07～7．17 ng/mL与6．91～23．90 ng/mL的范围．4种目标物的加标回收率为70．23%～94．42%，RSD日间(n=3)在2．56%～11．95%之间，RSD日间(n=3)为3．50%～15．10%，表现出良好的准确度和精密度．

表4 4种加标硝基呋喃类药物的线性范围、LOD、LOQ、回收率与精密度

2．2．3 本方法与其他测定方法比较

将该方法在样品萃取方法、检测方法、处理时间(衍生化)、回收率、LOD与LOQ以及线性范围等方面与国家标准(GB/T 21311)、文献报道的方法进行比较．由实验结果可知，本方法仅需4．0 mg PPy纳米纤维和100 μL洗脱剂便可得到最佳的方法检出限(2．07～7．17 ng/mL)以及良好的加标回收率(70．23%～94．42%，RSD < 15．10%，n=3)，方法简便低耗且高效，在23．0 min内可完成4个样品的同时处理，且本方法使用的仪器设备要求相对于其他方法使用的仪器设备要求较低．由表5可知，除了本实验方法外，其他方法都需要衍生化处理，时间较长，而且衍生化方法使用不当会损坏色谱柱、某些衍生化试剂需氮气吹干、衍生化不完全，影响灵敏度等以及衍生化试剂不当，产物分子量过大，影响实验结果．

表5 本方法与文献报道猪肉中硝基呋喃类检测方法比较

2．3 硝基呋喃类药物的色谱图

参考相关文献[27-34]，并通过实验确定流动相与流动相梯度洗脱程序(见表1)，在该缓冲体系下，如图8所示，4种硝基呋喃类药物的峰形较好，杂峰对主峰的干扰减少，目标峰和杂质峰能够完全分离，有利于HPLC-UV对样品进行检测分析．

图中(a)(c)：①呋喃妥因；②呋喃西林；③呋喃唑酮；④呋喃它酮图8 硝基呋喃类药物柱上液(a)、柱下液(b)及洗脱液(c)的色谱图

3 结论与讨论

本实验使用的材料是PPy纳米纤维，相比国家标准、文献报道的方法不仅操作简单方便、化学试剂用量少、成本较低；而且由于PFSPE的填料使用量少，此实验仅需4 mg；8 mol/L硫酸-甲醇(15∶85)混合溶液作为洗脱液时，使用量仅为100 μL，大大减少了对人体和环境的伤害；基质中适当添加NaCl溶液，可以提高洗脱效率，其最佳浓度为0．18 g/mL；PPy纳米纤维固相萃取柱可重复使用2次，低耗、绿色环保，使其具有很好的实际应用价值．此外，该方法前处理不需衍生化和氮气吹干就能实现浓缩样品，大大缩短了前处理的时间，且仪器设备要求相对于较低．

本实验对萃取条件进行选择和优化，建立了猪肉中硝基呋喃类药物的纳米纤维固相萃取-高效液相色谱测定方法．应用纳米纤维固相萃取柱对样品进行净化提取，有效地减少了基体中其他成分对目标物的干扰，提高了灵敏度，回收率高，重现性较好．结果表明，该方法更加简便、高效、低耗、绿色，结果准确可靠，有机溶剂用量少，适用于猪肉中硝基呋喃类药物的检测．