柚皮素对溃疡性结肠炎小鼠肠组织中miR-30a-3p/PTEN信号轴表达的影响*

2022-07-23陈琼梅红王宝香赵玉霞高源

西部医学 2022年7期

陈琼梅红王宝香赵玉霞高源

(华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院 1.消化内科；2.内镜中心，湖北武汉 430016)

溃疡性结肠炎是一种反复发作、病因不明的慢性结肠炎，被认为是结肠癌的癌前症状，世界卫生组织(WHO)列为现代难治性疾病之一[1]。目前，现代医学治疗常用水杨酸盐、皮质类固醇和免疫抑制剂等药物对溃疡性结肠炎进行治疗，优势在于能够迅速控制炎症，诱导缓解，但长期服用存在副作用大的问题[2]。中草药已被证明可有效治疗慢性炎性疾病，且副作用较小。柚皮素是一种生物类黄酮，具有抗炎和抗氧化剂等多种功能[3]。研究发现，柚皮素通过减少肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的积累和抑制细胞凋亡，对肠缺血/再灌注损伤具有保护作用，但其对溃疡性结肠炎的研究较少[4]。溃疡性结肠炎的病变部位主要见于结肠黏膜下层到整个黏膜的区域，表现为炎症诱导的肠细胞凋亡过度[5]。10号染色体缺失张力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)，通过调控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路，有助于调节炎症反应和肠炎的肠上皮细胞凋亡[6]。微小RNA(microRNA，miRNA)在细胞代谢调节中起着重要作用[7]。在脂多糖诱导的脓毒症中，miR-30a-3p过表达可以抑制脂多糖诱导的细胞凋亡[8]。利用TargetScan软件发现，miR-30a-3p通过调控PTEN的表达参与细胞的病理生理过程，提示PTEN可能是miR-30a-3p的潜在靶点。因此，本研究通过制备溃疡性结肠炎模型，观察柚皮素对该模型的治疗作用，并探讨miR-30a-3p/PTEN信号轴在整个过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物选取60只健康BALB/c小鼠，雄性，购自武汉大学实验动物中心，体质量(20±2) g，动物许可证号：HNXK(鄂)2020-0005，适应性喂养在温度(23±2)℃，相对湿度60%～70%，光照12 h明暗交替的环境中1周。本实验小鼠的处理符合动物伦理要求，并经医院伦理委员会审核同意。

1.2 主要试剂与仪器泼尼松龙、柚皮素和右旋葡聚糖硫酸钠(Dextran Sodium Sulfate，DSS) (美国Sigma公司)；苏木素染色液(上海碧云天生物技术研究所)；白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、PTEN、PI3K、Akt和半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；mRNA反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒(上海生工生物技术有限公司)；引物由上海生工生物技术有限公司合成；组织脱水机、包埋机、全自动轮转切片机等病理配套设备(上海珂淮仪器有限公司)；XSP-9CA显微镜(上海光学仪器一厂)；MultiSkan FC型酶标仪[美谷生物科技(浙江)有限公司]；NanoDrop2000c型蛋白核酸检测仪(美国Thermo公司)；CFX96型实时荧光定量PCR仪(美国BD公司)。

1.3 分组及造模小鼠按随机数字表法均分为阴性对照组、模型组、阳性对照组、柚皮素低剂量组、柚皮素中剂量组和柚皮素高剂量组。阴性对照组灌胃给予生理盐水(灌胃体积0.2 mL/10g)，其余各组灌胃给予含5% DSS的生理盐水溶液(灌胃体积0.2 mL/10g)，连续给予两周后阴性对照组和模型组灌胃给予生理盐水(0.2 mL/10g)，阳性对照组灌胃给予泼尼松龙(2 mg/kg)，柚皮素低、中、高剂量组分别灌胃给予柚皮素(剂量依次为50、100、200 mg/kg)，持续给予7d[9-10]。观察整个实验期间小鼠的进食、饮水和精神状态等一般情况，对小鼠进行称重、观察粪便性状和便血情况，计算疾病活动度评分(Disease activity index，DAI)，DAI=(体重下降分数+大便性状分数+便血情况分数)/3。脊髓脱臼处死小鼠，取整段结肠(回盲部至肛门)肉眼观察黏膜及浆膜面的变化。将肠组织分成两份，一份用福尔马林固定，其余组织液氮保存。

1.4 肠组织形态学检查肠组织经脱水、包埋、切片(1 μm)，进行苏木精-伊红(HE)染色，用显微镜观察肠组织学变化。

1.5 ELISA法检测肠组织中IL-4、IL-10、TNF-α、PTEN、PI3K、Akt和Caspase-3蛋白水平取部分冻存的肠组织，制成匀浆，将相应一抗稀释至10 μg/mL，加入到96孔板中(0.1 mL/孔)，4℃过夜，洗涤3次，加肠组织匀浆(0.1 mL)于上述反应孔中，37℃孵育1 h；加入新配置相对应的二抗0.1 mL，孵育1 h；加入新配置的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-Tetramethyl benzidine，TMB)底物溶液0.1 mL，显色20 min；加入2 mol/L硫酸0.05 mL终止反应，于450 nm处测各孔吸光度(A)值。

1.6 实时荧光PCR(RT-PCR)检测肠组织中miR-30a-3p、PTEN、PI3K、Akt和Caspase-3 mRNA水平取部分冻存的肠组织，制成匀浆，加入1 mL Trizol法提取总RNA，用NanoDrop 2000c型蛋白核酸检测仪进行RNA的浓度和纯度的测定，根据RNA反转录试剂盒说明合成cDNA，再根据荧光定量PCR试剂盒说明，制备20 μL反应体系进行扩增，在CFX-96 PCR扩增仪中进行扩增。反应条件为预变性(95℃，4 min)、变性(94℃，30 s)、退火(58℃，30 s)、延长(72℃，1 min)，共40个循环，采用 2-△△Ct法计算mRNA的相对表达量(以GAPDH作为内对照)。引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结果

2.1 柚皮素对小鼠DAI评分的影响造模结束时，与阴性对照组比较，其余各组小鼠DAI评分均升高(P<0.05)；给予治疗后，与模型组比较，阳性对照组和各柚皮素剂量组小鼠DAI评分较模型组均降低，各柚皮素剂量组效应呈剂量反应关系(P<0.05)；柚皮素高剂量组与阳性对照组DAI评分差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 各组小鼠DAI评分比较

2.2 柚皮素对小鼠结肠病理的影响阴性对照组小鼠结肠无明显病理改变；模型组小鼠结肠有部分肠壁凹陷，形成溃疡，周围组织水肿明显，部分细胞坏死、脱落，炎性细胞浸润；柚皮素低剂量组和柚皮素中剂量组小鼠结肠也可见到溃疡，但组织水肿、细胞坏死和炎细胞浸润减轻；阳性对照组和柚皮素高剂量组小鼠结肠溃疡较少，但组织水肿、细胞坏死和炎细胞浸润明显减轻。见图1。

图1 各组大鼠肾脏组织形态学病理图(HE染色，200×)

2.3 柚皮素对小鼠结肠组织中IL-4、IL-10和TNF-α水平影响与阴性对照组比较，其余各组小鼠结肠组织中IL-4和TNF-α水平均升高，IL-10水平均降低(均P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和各柚皮素剂量组小鼠结肠组织中IL-4和TNF-α水平均降低，IL-10水平均升高，各柚皮素剂量组效应呈剂量反应关系(均P<0.05)；柚皮素高剂量组与阳性对照组各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组小鼠结肠组织中IL-4、IL-10和TNF-α水平比较

2.4 柚皮素对小鼠结肠组织中miR-30a-3p、PTEN、PI3K、Akt和Caspase-3 mRNA及蛋白水平的影响与阴性对照组比较，其余各组小鼠结肠组织中miR-30a-3p、PI3K和Akt mRNA相对表达量及蛋白水平均降低，PTEN和Caspase-3 mRNA相对表达量及蛋白水平均升高(均P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和各柚皮素剂量组小鼠结肠组织中miR-30a-3p、PI3K和Akt mRNA相对表达量及蛋白水平均升高，PTEN和Caspase-3 mRNA相对表达量及蛋白水平均降低，各柚皮素剂量组效应呈剂量反应关系(均P<0.05)；柚皮素高剂量组与阳性对照组各指标差异无统计学意义(P>0.05)。见表4～5、图2。

表4 各组小鼠结肠组织中miR-30a-3p、PTEN、PI3K、Akt和Caspase-3 mRNA比较

表5 各组小鼠结肠组织中miR-30a-3p、PTEN、PI3K、Akt和Caspase-3 蛋白比较

图2 各组小鼠结肠组织中miR-30a-3p、PTEN、PI3K、Akt和Caspase-3 mRNA扩增情况

3 讨论

溃疡性结肠炎是一种复发性慢性结肠炎，因其顽固性和易复发性被列为现代难治性疾病。关于溃疡性结肠炎的临床药物开发和治疗的研究较多，但目前还未发现突破性药物。因此，探讨新的溃疡性结肠炎治疗药物具有重要意义。多酚或酚类化合物是从药用植物中提取的天然活性成分，类黄酮被归类为多酚的结构基团。研究发现，白藜芦醇、槲皮素、杨梅素和柚皮素等多酚类和类黄酮化合物被认为对醋酸和DSS诱导的小鼠实验性结肠炎有保护作用[11]。柚皮素具有较强的抗炎和免疫调节功能。在溃疡性结肠炎发生过程中，游离脂肪酸(FFA)水平升高，FFA通过对Toll样受体4多克隆抗体(TLR4)的作用产生促炎细胞因子，然后启动核转录因子κB(NF-κB)和c-JunN端蛋白激酶(c-JNK)级联反应，导致肠系膜脂肪组织的慢性炎症[12]。TNF-α诱导多种炎症基因表达，促进溃疡性结肠炎的发展[13]。同时，IL-4通过刺激中性粒细胞浸润和趋化产生组织坏死和破坏，抑制Th1/Th2细胞分泌IL-10产生，在溃疡性结肠炎的发病机制中起着关键作用[14]。本研究结果显示，柚皮素能降低溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中IL-4和TNF-α水平降低，同时升高IL-10水平，提示柚皮素对促炎细胞因子有抑制作用，从而对溃疡性结肠炎发挥保护作用。

溃疡性结肠炎通常表现为体重减轻、粪便粘稠和便血，统称为DAI，是评价溃疡性结肠炎严重程度的一个众所周知的参数，也是药物治疗效果的一个预测因素[15]。本研究结果显示，给予DSS灌胃各组小鼠DAI评分增加，再给予柚皮素治疗后，DAI评分显著降低，且其作用效果与泼尼松龙类似。泼尼松龙是溃疡性结肠炎的标准临床治疗方法，表明柚皮素对溃疡性结肠炎具有治疗作用。同时，本研究对柚皮素治疗溃疡性结肠炎的作用机制进行探讨。

研究证实，miRNA与炎症和免疫系统功能有关。在上皮细胞中，脂多糖下调miR-30a-3p，miR-30a-3p模拟物显著抑制了Ⅱ型上皮细胞凋亡[16]。同时，miR-30a-3p过表达也可以改善脓毒症诱导的身体损伤[17]。本研究结果显示，柚皮素能促进结肠组织中miR-30a-3p表达。最新研究表明，在PTEN/PI3K/AKT信号通路中，PTEN能编码一种具有蛋白质和脂质磷酸酶活性的多功能蛋白，干扰PI3K/AKT信号转导，导致细胞周期G期的阻断[18-19]。当缺乏PTEN表达时，PI3K被激活后可催化3,4,5 -磷酸磷脂酰肌醇三磷酸磷酸化，然后激活Akt，抑制细胞凋亡并促进细胞增殖，失去对细胞生长的控制[20]。既往研究报道，miRNA通过直接下调PTEN调控PI3K/Akt信号通路，从而促进Akt磷酸化，影响Th2细胞因子IL-4、IL-8、IL-10的表达，打破Th1/Th2细胞因子平衡，导致促炎细胞因子的产生减少，提示miRNA与PTEN/PI3K/Akt信号通路相关[21]。同时，结肠细胞凋亡增加可以加重溃疡性结肠炎小鼠的病情，而炎症反应可以促进细胞凋亡[22-24]。本研究结果显示，过表达的miR-30a-3p抑制PTEN的表达，促进PI3K和Akt表达，从而抑制Caspase-3表达。