苍耳亭通过调控LOXL1-AS1/miR-520d-5p轴对白血病细胞增殖和凋亡的影响*

2022-07-23王丹丹饶琦郭彩玲赵寅史岑敏

西部医学 2022年7期

王丹丹饶琦郭彩玲赵寅史岑敏

(四川大学华西医院血液内科,四川成都 610041)

白血病是一种恶性克隆性造血干细胞疾病。由于白血病细胞增殖失控、凋亡受阻、分化障碍等原因，机体正常造血功能受到抑制，并导致贫血和免疫缺陷等严重症状。苍耳亭是从菊科植物苍耳Xanthiumsibiricum干燥成熟带总苞的果实中提取的天然倍半萜内酯，具有抗癌、抗血管生成、抗炎、抗寄生虫等作用[1-2]。研究报道苍耳亭对宫颈癌细胞具有明显的抑制增殖和促进凋亡作用[3]。苍耳亭通过干扰核因子kB通路诱导非小细胞肺癌细胞G2/M周期阻滞和凋亡[4]。然而，苍耳亭对白血病抗癌作用和机制鲜有报道。长链非编码RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)是研究最多的非编码类型，其通过直接或间接地调控细胞增殖、分化、凋亡和转移等相关基因表达，具有抑癌或致癌基因功能[5-6]。lncRNA类赖氨酰氧化酶1反义RNA1(LOXL1-AS1)位于15q24.1，研究报道肺癌中LOXL1-AS1高表达明显增强肿瘤细胞增殖和侵袭能力[7]。干扰LOXL1-AS1表达明显抑制胃癌细胞增殖和转移[8]。靶基因预测显示miR-520d-5p是LOXL1-AS1的潜在靶点，有研究指出急性T淋巴细胞白血病患者中miR-520d-5p表达下调[9]。咪达唑仑通过上调miR-520d-5p表达诱导肺癌细胞凋亡[10]。然而，LOXL1-AS1是否靶向miR-520d-5p调控白血病进展并不清楚。本研究通过分析苍耳亭对白血病细胞增殖、凋亡以及LOXL1-AS1、miR-520d-5p表达的影响，旨在探讨苍耳亭在白血病中潜在抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料白血病K-562细胞购自中国典型培养物保藏中心；RPMI-1640、胎牛血清购自美国Gibco公司；苍耳亭(纯度≥98%，批号20200110)购自上海源叶生物；RNAiso Plus试剂购自大连Takara生物公司；荧光素酶报告载体、PCR引物、miR-520d-5p模拟物(mimics)及其阴性对照(miR-NC)、针对LOXL1-AS1小干扰RNA(si-LOXL1-AS1)及其阴性对照(si-NC)、LOXL1-AS1过表达质粒(pcDNA-LOXL1-AS1)购自广州锐博生物公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)凋亡检测试剂盒购自南京诺唯赞生物公司；细胞计数试剂盒(CCK-8)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)兔单克隆抗体(AF1186)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2兔多克隆抗体(AF6285)、Bcl相关X蛋白(Bax)兔单克隆抗体(AF1270)、山羊抗兔IgG(A0208)购自上海碧云天生物公司；反转录试剂盒、miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒、lnRcute lncRNA荧光定量检测试剂盒购自北京天根生化科技公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和苍耳亭浓度筛选将K-562细胞培养在RPMI-1640培养基中，培养基中添加10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素，放入37℃、含5% CO2培养箱培养。取5×103个第三代对数期K-562细胞接种6孔板，分别用含0、5、15、30、60、90 μmol/L苍耳亭[3]的培养液孵育K-562细胞24 h，每孔K-562细胞中加入10 μL的CCK-8溶液，孵育2 h后，分光光度计测定450 nm处吸光度(OD)。增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。根据增殖抑制率选择6、20、60 μmol/L苍耳亭进行实验。

1.2.2 细胞转染和实验分组取2×105个对数期K-562细胞接种6孔板，当细胞密度为50%时利用Lipofectamine 3000分别转染si-LOXL1-AS1、si-NC、pcDNA-LOXL1-AS1至K-562细胞，转染48 h采用RT-qPCR检测LOXL1-AS1水平已验证转染效果。实验分组：对照组为正常培养的K-562细胞；苍耳亭6 μmol/L组、苍耳亭20 μmol/L组、苍耳亭60 μmol/L组为分别用含6、20、60 μmol/L苍耳亭的培养液孵育K-562细胞24 h；si-NC组、si-LOXL1-AS1组为分别转染si-NC、转染si-LOXL1-AS1的K-562细胞；苍耳亭+pcDNA-LOXL1-AS1组为含60 μmol/L苍耳亭的培养液孵育转染pcDNA-LOXL1-AS1的K-562细胞24 h。每组设置3个复孔，实验独立重复3次。

1.2.3 CCK-8法检测K-562细胞增殖将转染si-LOXL1-AS1、si-NC或者pcDNA-LOXL1-AS1的K-562细胞、未转染K-562细胞以5×103个/孔密度接种96孔板，按照“1.2.2”实验分组加入一定浓度的苍耳亭孵育细胞24 h，随后按1.2.1步骤测定各孔OD值，根据OD值计算增殖抑制率。每组设置3个复孔，实验独立重复3次。

1.2.4 流式细胞术检测K-562细胞凋亡率将各组K-562细胞重悬于100 μL的1×结合缓冲液中，细胞密度为1×106个/mL。分别取5 μL的Annexin V-FITC、碘化丙啶(PI)加入到述细胞悬液中，避光孵育15 min。补加400 μL的1×结合缓冲液并混合均匀。流式细胞仪检测各组K-562细胞凋亡情况。

1.2.5 蛋白质印记检测Bax和Bcl-2蛋白表达用含1%蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液提取各组K-562细胞总蛋白。蛋白定量后，取30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE，设置电压100 V，时间90 min。然后湿转蛋白至硝酸纤维素膜上，设置电流20 mA过夜。用5%脱脂乳封闭膜2 h，4℃下用Bax抗体(1∶800)、Bcl-2抗体(1∶500)、内参GAPDH抗体(1∶2000)孵育过夜，室温下用二抗(1∶1000)孵育1 h。洗膜后，用ECL试剂盒检测蛋白条带。以Image J软件测得的Bax(或Bcl-2)与GAPDH条带灰度值比值表示Bax(或Bcl-2)蛋白相对表达量。每组设置3个复孔，实验独立重复3次。

1.2.6 RT-qPCR检测LOXL1-AS1和miR-520d-5p表达用RNAiso Plus试剂提取各组K-562细胞的总RNA。利用逆转录试剂盒合成cDNA，再用miRNA、lncRNA荧光定量检测试剂盒分别检测LOXL1-AS1、miR-520d-5p表达。miRNA和lncRNA的相对表达量以2-ΔΔCt法计算。LOXL1-AS1：上游5′-GA TATGTTGGATGATGGA-3′，下游5′-GATATGTT GGATGGATGA-3′；内参GAPDH：上游5′-GAAG GTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游5′-GAAGATGGT GATGGGATTTC-3′；miR-520d-5p：上游5′-TGAGT CTACAAAGGGAAGCCC-3′，下游5′-TCTCAAAC CGTAACCCACCA-3′；内参U6：上游5′-CTCGCTT CGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAAT TGCGT-3′。每组设置3个复孔，实验独立重复3次。

1.2.7 双荧光素酶报告实验使用Starbase在线数据库预测LOXL1-AS1的靶基因，发现miR-520d-5p是其潜在靶点。将包含miR-520d-5p结合区域的LOXL1-AS1的野生(WT)序列插入荧光素酶报告质粒psiCHECK-2的下游，构建荧光素酶报告载体WT-LOXL1-AS1。将含miR-520d-5p结合位点的LOXL1-AS1序列进行突变(MUT)，构建突变型荧光素酶载体MUT-LOXL1-AS1。将上述载体分别与miR-520d-5p mimics、miR-NC共转染K-562细胞。转染48 h后，以海肾荧光素酶为内控，双荧光素酶活性系统测定K-562细胞的相对荧光素酶活性。每组设置3个复孔，实验独立重复3次。

2 结果

2.1 不同浓度的苍耳亭对K-562增殖的影响采用不同浓度的苍耳亭孵育K-562细胞，与0 μmol/L相比，5 μmol/L、15 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L、90 μmol/L的苍耳亭孵育后细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)，后续选择6 μmol/L、20 μmol/L、60 μmol/L浓度进行实验。见图1。

图1 苍耳亭对K-562增殖的影响

2.2 苍耳亭对K-562细胞增殖、凋亡的影响与对照组比较，苍耳亭(6、20、60 μmol/L)组K-562细胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)；随着苍耳亭浓度的升高，其对K-562细胞增殖、Bcl-2蛋白表达的抑制作用以及对细胞凋亡、Bax蛋白表达的促进作用逐渐增强。见图2、表1。

图2 苍耳亭对K-562凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

表1 苍耳亭对K-562细胞增殖、凋亡的影响

2.3 苍耳亭对K-562中LOXL1-AS1和miR-520d-5p表达的影响与对照组比较，苍耳亭(6、20、60 μmol/L)组K-562细胞LOXL1-AS1表达显著降低(P<0.05)，miR-520d-5p表达显著升高(P<0.05)。随着苍耳亭浓度的升高，其对K-562细胞LOXL1-AS1表达的抑制作用和对miR-520d-5p表达的促进作用逐渐增强。见表2。

表2 苍耳亭对K-562中LOXL1-AS1和miR-520d-5p表达的检测

2.4 干扰LOXL1-AS1对K-562细胞增殖、凋亡的影响 si-LOXL1-AS1组K-562细胞LOXL1-AS1表达显著低于si-NC组(P<0.05)，提示转染si-LOXL1-AS1后K-562细胞LOXL1-AS1表达受到抑制。与si-NC组比较，si-LOXL1-AS1组K-562细胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图3、表3。

图3 干扰LOXL1-AS1对K-562凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

表3 干扰LOXL1-AS1对K-562细胞增殖、凋亡的影响

2.5 LOXL1-AS1和miR-520d-5p靶向关系 Starbase在线数据库预测到miR-520d-5p与LOXL1-AS1序列间存在互补结合位点(图4)。检测相对荧光素酶活性显示，同与WT-LOXL1-AS1共转染，转染miR-520d-5p mimics后K-562细胞相对荧光素酶活性显著低于转染miR-NC(P<0.05)；同与MUT-LOXL1-AS1共转染，转染miR-520d-5p mimics后K-562细胞相对荧光素酶活性与转染miR-NC比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

图4 LOXL1-AS1和miR-520d-5p的互补序列

表4 双荧光素酶报告实验

2.6 过表达LOXL1-AS1对苍耳亭处理的K-562增殖和凋亡的影响与对照组比较，苍耳亭组K-562细胞LOXL1-AS1表达、Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)，miR-520d-5p表达、增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表达显著升高(均P<0.05)；与苍耳亭组比较，苍耳亭+pcDNA-LOXL1-AS1组K-562细胞LOXL1-AS1表达、Bcl-2蛋白表达显著升高(均P<0.05)，miR-520d-5p表达、增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表达显著降低(均P<0.05)。见图5、表5。

图5 LOXL1-AS1可逆转苍耳亭对K-562凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

表5 LOXL1-AS1可逆转苍耳亭对K-562抑制率糖酵解活性和凋亡的影响

3 讨论

尽管白血病的治疗有明显改善，但传统化疗药物的疗效较低，多数患者复发频繁，预后较差，死亡率仍然居高不下[11]。天然产物由于其来源广泛、价格低廉、抗肿瘤活性良好等优势已成为化疗药物的主要来源。近年来，苍耳亭已被证实对多种癌细胞具有显著的抗肿瘤活性。蔡亚云等[12]报道苍耳亭对体内外肝癌细胞增殖和转移具有较强的抑制作用。狄泽敏等[13]证实苍耳亭可激活内质网应激，诱导胶质瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长。Li等[14]指出苍耳亭可能通过激活Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路进而抑制小鼠黑色素瘤细胞增殖，抑制血管生成。本研究发现选择6、20、60 μmol/L苍耳亭浓度进行实验，苍耳亭处理后白血病细胞K-562细胞增殖抑制率显著升高，凋亡率明显增加。此外，促凋亡蛋白Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，这与苍耳亭的凋亡诱导作用一致。以上研究表明苍耳亭通过抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡在白血病中具有抗肿瘤活性。

LOXL1-AS1是多种肿瘤进展的致癌因子，胃癌中LOXL1-AS1表达上调预示患者预后不良，并通过诱导胃癌细胞增殖、转移加速胃癌的恶化[15]。前列腺癌中LOXL1-AS1表达增加，下调LOXL1-AS1可以抑制肿瘤细胞增殖和细胞周期进展[16]。本研究发现苍耳亭处理显著下调K-562细胞中LOXL1-AS1表达水平。干扰LOXL1-AS1可抑制K-562细胞增殖，下调Bcl-2表达，上调Bax表达，促进细胞凋亡，这与苍耳亭抗肿瘤功能类似，提示LOXL1-AS1可能介导苍耳亭抗肿瘤作用。此外，本研究发现苍耳亭处理显著上调miR-520d-5p水平。既往研究报道miR-520d-5p表达可能参与胃癌发生过程[17]。宫颈癌中miR-520d-5p通过靶向PTK2抑制癌细胞恶性生物学行为[18]。越来越多研究表明lncRNA可以直接与miRNA相互作用，调节miRNA表达和活性，参与多种细胞过程[19]。LOXL1-AS1通过靶向miR-423-5p参与肺腺癌发生发展[20]。本研究证实miR-520d-5p是LOXL1-AS1的直接靶点，且miR-520d-5p表达受LOXL1-AS1负向调控，提示LOXL1-AS1/ miR-520d-5p轴可能介导苍耳亭的抗肿瘤作用。进一步研究表明，过表达LOXL1-AS1明显减弱苍耳亭处理对K-562细胞增殖、凋亡以及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响，基本恢复细胞增殖能力和凋亡水平，表明苍耳亭可能通过调控LOXL1-AS1/ miR-520d-5p轴进而影响K-562细胞的增殖和凋亡。