兔VX2肝癌移植瘤模型的建立及其影像学评估*

邓丹 邱世香, 赵茂林 蒲嘉骐 钟立明

(1.南充市中心医院·川北医学院第二临床医学院介入科，四川 南充 637000；2.川北医学院医学影像学院，四川 南充 637000)

根据WHO公布的最新数据，全球肝癌2020年新发病例数达到91 万人，新增死亡病例数约83万人；在中国肝癌是仅次于肺癌的第二大致死性肿瘤[1]。肝癌具有恶性程度高、病情进展快等特点，临床仍是以手术切除为主，辅以放化疗、靶向药物治疗及介入治疗的多学科综合治疗。经导动脉灌注化疗栓塞(Transcatheter arterial chemoembolization,TACE)是肝癌非手术治疗最常用的治疗手段[2-3]。近年来关于介入治疗肝癌的研究也逐渐增多，大部分是前临床研究，在这些前临床研究中，动物肿瘤模型是实验研究的重要一环。兔VX2肝癌模型是目前肝癌研究中最常见的肿瘤模型，被广泛应用于肿瘤影像学、治疗效果评估等方面。兔VX2肝癌模型的建立有多种方法，但是各种方法的成瘤率略有差异。本文拟用开腹种植肿瘤组织块的方法建立兔VX2肝癌模型，运用增强CT扫描及血管造影的方法评估肿瘤的影像学表现，结合本课题组的经验及文献复习，探讨CT及血管造影在VX2肝癌移植瘤诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物及VX2荷瘤兔 新西兰大白兔40只，雄性，体重平均约2.5～3.5 kg，由川北医学院动物实验中心提供及饲养；VX2荷瘤兔2只，雄性，体重分别为2.8 kg和3.4 kg，购自华中科技大学动物实验中心。本实验动物处理符合动物伦理要求，并经医院伦理委员会审核同意。

1.2 VX2肿瘤的传代 动物活体传代是VX2肿瘤的一种保存方法，将VX2肿瘤组织块或细胞悬浮液种植在实验兔大腿肌肉。根据本课题组的经验，接种肿瘤组织块的成瘤率较高、成瘤速度快。具体方法如下：剥离肿瘤组织并用无菌生理盐水清洗干净，选取边缘生长旺盛的、鱼肉样的组织，用眼科剪剪碎成1～2 mm3大小的瘤块并将其接种到受体兔的后大腿肌肉内，2～3周即可成瘤。见图1。

图1 VX2肿瘤的传代(后大腿肌肉内种植)

1.3 兔VX2肝癌模型的建立 40只新西兰大白兔经耳缘静脉注射20 mg/mL的戊巴比妥钠4～5 mL,麻醉满意后固定于自制简易手术台上。剑突下备皮，常规消毒铺巾。沿剑突下切开皮肤3～4 cm，沿腹白线做正中切口，暴露肝左叶。用血管钳在脏面做深约1 cm的窦道，然后置入1～2粒肿瘤组织块，用明胶海绵条封闭窦道防止肿瘤的播散及止血。将肝左叶回纳至腹腔，依次缝合腹膜层、腹壁肌肉、皮下组织及皮肤，常规消毒手术区域。手术后注射40万单位青霉素肌肉内注射3～4 d，防止感染，促进伤口愈合。见图2。

图2 兔VX2肝癌模型建立

1.4 增强CT扫描及血管造影 造模后第7、14天按1.3中的方法麻醉实验兔，取仰卧位固定于检查床。采用西门子Somatom Definition双源CT做上腹部增强扫描，观察肿瘤成瘤及其生长情况。扫描参数为：80 KV，120 mA，FOV25，层厚为1.5 mm，层间距为3 mm。造影剂为碘克沙醇(美国GE)，给药速度为0.5 mL/s，造影剂总量为8 mL。从推造影剂第20～35秒扫描动脉期，第35～60秒扫门静脉期，第90～100秒扫延迟期。血管造影：右侧腹股沟区剪毛、备皮，常规消毒铺巾。在股动脉搏动最强点处皮肤上作一长约3～4 cm的切口，分离股动脉，两端穿以丝线备用。运用Seldinger法穿刺右侧股动脉，送入短导丝，插入5 F导管鞘，经导管鞘直接将2.7 F的微导管送入腹主动脉内，约在第12胸椎水平进行造影，寻找腹腔干的位置，在腹腔干位置造影。将微导管插入腹腔干造影，确认肝动脉的开口及走向，将微导管超选至肝动脉进行造影，观察有无肿瘤染色区域。造影结束后拔出导管，用丝线结扎股动脉，缝合皮下组织及皮肤。见图3。

图3 血管造影过程

1.5 病理学检查 对实验兔实施安乐死，然后解剖其尸体，观察肿瘤的数目、大小、质地以及转移情况；选取肿瘤边缘鱼肉样的具有活性的癌组织以及周围的癌旁组织，制作石蜡切片并进行HE染色，在显微镜下观察肿瘤细胞的形态。

2 结果

2.1 一般情况 40只实验兔在接种肿瘤后1～3 d均出现活动度减少，精神萎靡，进食少等症状；术后4～7 d逐渐恢复，未出现严重的不良事件。肿瘤成瘤后，随着肿瘤的生长及远处转移，实验兔逐渐出现进食少、体重逐渐减轻、精神萎靡等，最终表现为恶病质。

2.2 肿瘤生长情况 兔后腿肌肉内肿瘤大约14 d能触及1 cm左右的小结节，大约在21 d后可触及2～4 cm的结节。开腹种植术后7 d左右，做增强CT扫描发现，实验兔肝脏内有1～2 cm的病灶，约2～3周后病灶内部开始出现坏死，且肿瘤组织生长迅速；3周后肿瘤内部出现大片坏死，肿瘤生长速度进一步加快。

2.3 影像学评估

2.3.1 CT表现 平扫时病灶表现为肝实质内类圆形低密度影，边界清楚，增强扫描时动脉期病灶边缘明显强化，门静脉期及延迟期病灶造影剂迅速清退；部分实验兔发现肝内转移灶及增大淋巴结影。见图4。

图4 CT表现

2.3.2 血管造影表现 肝动脉及其分支迂曲、增粗，可见大量病理血管显影，肿瘤染色征象明显；肿瘤血管主干被瘤体推压呈典型“抱球征”改变，其外周可见从环绕的肿瘤主干血管上分出的肿瘤滋养血管绕行肿瘤，从周边向中心推进，形成不同厚度的环圈形周边深染、中心相对淡染的肿瘤染色结节。分支深入肿瘤内部，部分可见“血池征”。经碘化油栓塞后，肿瘤血供明显减少。见图5。

图5 血管造影表现

2.4 病理学表现 40只实验兔均成瘤，32只观察到肝脏单个病灶；有5只观察两个病灶，有3只观察到两个以上的病灶；有4只观察到腹膜转移灶；有2只观察到腹壁转移灶。

2.4.1 大体表现 后大腿肌肉内肿瘤表现为突出于体表的软组织结节，质地稍硬，边界不清。将肿瘤组织剥离后肿瘤表面可见粗大、迂曲的供血血管；肿瘤被完整的纤维包膜包被，可见鱼肉样的肿瘤组织与正常肌肉组织的明显分界。肝脏内肿瘤表现为团块状的肿瘤组织，呈灰白色，与肝实质分界清晰，有包膜；肿瘤内部坏死物质呈豆腐渣样，有活性的肿瘤组织表为鱼肉样。见图6。

图6 肿瘤大体图片

2.4.2 镜下表现 显微镜下观察到肿瘤与正常组织以纤维包膜分隔，纤维包膜内可见明显增大的肿瘤细胞，细胞核增大、细胞异型明显、排列紊乱、呈巢状分布或弥漫分布；肿瘤组织内出现片状变性、坏死、结构不清的区域。见图7。

图7 肿瘤组织的HE染色结果(200 ×)

3 讨论

目前较为常用的肝癌研究的实验动物主要是鼠类、兔、猪、犬等，其中兔体型适中，便于介入操作、饲养方便，被广泛应用于肿瘤介入及影像方面的实验研究中[4-5]。肝癌模型的建立方法有：①化学诱导模型。②基因工程小鼠模型。③移植瘤模型[6-8]。本研究中采用的是移植瘤模型的方法，该方法实体肿瘤的组织或细胞植入实验动物体内，建立的肿瘤模型更加贴近人类实体癌症的本质。

VX2肿瘤模型历史悠久，它可以植入到肝、肾、肺等多种器官内，但这个模型只能建立在兔子的基础上。VX2的肝肿瘤模型主要由肝动脉血液供应,其快速增长证明了该模型类似于人类肝细胞癌的特征[8]。本课题组研究臭氧治疗肿瘤的进展时发现VX2肿瘤模型被广泛应用于动物实验[9]。兔VX2肝癌模型的建立方法包括：影像设备引导下经皮穿刺种植法、开腹手术种植法、移植肿瘤组织块和接种肿瘤细胞悬液法等[10-12]。经皮穿刺种植法手术时间短、感染风险低且节约实验成本；但针道种植转移、异位种植的几率较高。开腹手术种植成瘤率高、准确度高、异位种植风险低，不过手术耗时长、感染风险高。多项研究表明肿瘤组织块接种法成瘤率更高、成瘤的时间较短，可节约实验时间[13]。也有研究表明超声引导经皮穿刺肿瘤组织条种植法对肝组织的损伤小,成功率高、模型性质稳定[14]。目前兔VX2肝癌模型已在介入治疗、影像医学以及外科手术等方面研究中广泛应用，Doemel等[15]和Berz等[16]通过VX2肝肿瘤模型来研究不同化疗栓塞方案对肝肿瘤代谢以及免疫的影响；Van等[17]利用VX2肿瘤模型发现碘油可以作为cTACE治疗效果的成像生物标志，为临床肝癌患者的治疗管理起到了很大的帮助。Murai等[18]在研究射频消融联合顺铂对肺癌的治疗效果时同样采用了VX2肺肿瘤模型。VX2肿瘤模型的建立方法较多，在以往的研究中，兔肝脏VX2肿瘤的诱导途径有多种，包括剖腹和经皮穿刺植入肿瘤细胞悬液和肿瘤碎片悬液[19]。曾功君等[20]在很早前就比较了超声引导下肿瘤组织混悬液注射法、手术直视下肿瘤组织块包埋、手术直视下肿瘤组织混悬液注射法三种方式的成瘤概率，结果发现手术直视下肾内VX2肿瘤组织混悬液注射法建立兔肾VX2肿瘤模型的成功率较其他两种方法高。本研究应用的是开腹种植肿瘤组织块法，所有实验兔均成瘤(100%)，根据经验，发现肿瘤的生长速度和大小与接种瘤块的数目、大小有着密切的联系。瘤块较大、接种数目越多的肿瘤生长速度越快。

B超是肝癌的首选普查方法，CT可以明确肿瘤生长的位置、大小、形态及血供情况，评估疗效等。DSA能够较好的显示肿瘤血管染色征象，直观地显示肿瘤的血供情况以及评估TACE术后有无新生血管的形成。现在对于兔VX2肝癌血管造影有两种方法，一种是采用Seldinger法经股动脉穿刺插管[21]，另一种是开腹经腹腔干或肝动脉直接插管[22]。也有研究通过显微手术的方法，通过胃十二指肠动脉留置导管插管[23]。本研究采用的是Seldinger法经股动脉穿刺插管，首先暴露了实验兔的右侧股动脉，这与临床上直接经皮穿刺有所不同，主要是由于兔的皮肤较厚，不便于直接穿刺操作。其次是要熟练实验兔的血管解剖结构，以便于更加精确而迅速地完成操作，减少术中出血。

4 结论

开腹种植肿瘤组织块是目前首选的建模方法，研究人员可根据自己的实验需求选择适合的建模方法。开腹手术种植肿瘤组织块法是一种较为完善的建模方法，成瘤率较高；兔VX2肝癌移植瘤模型是一种富血供肿瘤，主要由肝动脉供血；动态增强CT扫描能够实时的监测肿瘤的生长情况，在术前、术后评价方面具有重要价值，但是血管造影在显示肿瘤的供血动脉等方面仍具有优势，并且血管造影同时能兼顾治疗的作用。