基于有效组分检测的厚朴生物碱有效部位的制备及抗炎活性研究

★ 褚洪标 武继斌 赵丽娟 李少彤 郭玉洁 梁兆昌（井冈山大学医学院 江西 吉安 343009）

厚朴为木兰科植物，主要分布在陕西、甘肃、湖北、四川、贵州等地。厚朴的干皮、根皮以及枝皮，温味苦辛，无毒，入脾、胃、大肠，能温中下气，燥湿清痰，具有广谱抗菌、抗肿瘤、抗炎、保护心脑血管、抗溃疡及抗凝血等作用［1］。尽管已对厚朴的主要成分厚朴酚、和厚朴酚等酚类物质开展了较多研究，但针对厚朴中的生物碱成分研究较少［2-3］。厚朴生物碱含量的测定多采用滴定分析方法［4-5］，其提取及含量测定方法还不够完善。

中药有效部位由于能体现中药多成分、多靶点、多途径发挥药效的特点, 针对系列天然类似物进行有效部位的制备及活性测试，近年来成为中药、天然药物新药开发的重要方向之一［6］。鉴于厚朴总生物碱具有强的药理活性，通过研究其提取工艺，优化提取方法以提高提取率，可以为相关的药理活性实验以及结构修饰打下良好的物质基础。N-降荷叶碱是厚朴生物碱中含量最丰富的成分之一，本实验旨在建立高效液相色谱测定该成分的分析方法，便于评价及控制厚朴的品质。

基于上述分析方法，采用离子交换树脂分离富集技术，制备厚朴生物碱的有效部位，并对有效部位进行抗炎活性评价。为了探索N-降荷叶碱的抗炎机制，本实验采用分子对接技术，以TNF-α，IL-1β，COX-1，COX-2为作用靶点，研究N-降荷叶碱与4种炎症受体的结合方式，为厚朴的综合利用和深入开发提供实验依据。

1 仪器、材料及动物

1.1 仪器

LC-10AT型岛津高效液相色谱仪（日本岛津公司，岛津SPD-10A紫外检测器）；FA1004N型电子天平（上海菁海仪器有限公司）；SL-250型超声波清洗器（上海生析超声仪器有限公司）；RE-2000A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；DG-160中药材粉碎机（浙江瑞安飞达药材器械厂）；YLQ-Q4 耳肿打孔器 （济南益延科技发展有限公司）；沃特浦微量有机除热原型超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）；Sybyl-X 2.1 药物设计与筛选软件（Tripos公司）。

1.2 试药

厚朴样品于2018年8月采集于江西省井冈山，由井冈山大学医学院生药学教研室梁兆昌教授鉴定为木兰科植物厚朴Magnolia officinalisRehd. et Wils.的干燥树皮。对照品N-降荷叶碱为实验室自制（高效液相色谱法测定峰面积，纯度＞98 %）。001X7强酸性聚苯乙烯阳离子交换树脂、 D-72强酸性大孔阳离子交换树脂和D-152大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂（天津兴南允能高分子技术有限公司）。甲醇为色谱纯，娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。

1.3 实验动物

清洁级昆明种小鼠，平均体质量20 g，雌雄兼有，共312只（湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号为＜湘＞ 2011-0003）。

2 方法

2.1 N-降荷叶碱含量的测定

2.1.1 N-降荷叶碱对照品溶液制备精密称取自制的N-降荷叶碱对照品1.1 mg，置5 mL容量瓶中，按照流动相比例加甲醇和水至刻度线，摇匀，得到对照品溶液浓度为 0.22 mg/mL。

2.1.2 色谱条件Shimpack ODS色谱柱（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水溶液（90∶10），检测波长为285 nm；流速为 1 mL/min；柱温为25 ℃；进样量10 μL。在此条件下N-降荷叶碱与相关峰均能达到基线分离，在本法的色谱条件下，N-降荷叶碱分离度好，出峰完全且峰形较好，无基线漂移。见图1。

图1 N-降荷叶碱对照品（A）与厚朴生物碱供试品（B）高效液相色谱图

2.1.3 方法学考察

2.1.3.1 线性关系考察取“2.1.1”项下配制的对照品溶液，加适量流动相配成以下6个梯度浓度的对照品溶液：C1溶液13.75 μg/mL、C2溶液27.50 μg/mL、C3溶液55.00 μg/mL、C4溶液110.00 μg/mL、C5溶液146.70 μg/mL、C6溶液220.00 μg/mL。在“2.1.2”条件下，分别测定其峰面积。以浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=6 902.2X+17 803（r=0.999 5），在13.75～ 220.00 μg/mL范围内与峰面积的线性关系良好。

2.1.3.2 精密度试验取对照品溶液连续进样5 次，每次 10 μL，按“2.1.2”项下色谱条件测定峰面积，计算其RSD为0.72%，说明仪器的精密度较好。

2.1.3.3 重复性试验取厚朴生物碱同一样品 5 份，按 “2.1.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.2”项下色谱条件测定峰面积，计算其RSD为1.02%，表明方法的重复性良好。

2.1.3.4 稳定性试验取测得的N-降荷叶碱含量较高的001X7乙醇组的供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10 h在“2.1.2”项下条件下进样，测定其峰面积，计算得RSD为1.23%，说明该溶液在10 h内呈现出很好的稳定性。

2.1.3.5 加样回收率试验精密称取 6 份已测含量的厚朴生物碱样品适量，精密加入适量的N-降荷叶碱，按“2.1.2.3”项下方法制备所需溶液，按“2.1.2”项下色谱条件测定，计算加样回收率。结果显示N-降荷叶碱的平均回收率为95.76%，RSD为1.47%。

2.2 厚朴生物碱有效部位的制备

2.2.1 乙醇回流方法制备有效部位称取厚朴干皮粉末375 g，将药材均匀分配到3个1 000 mL圆底烧瓶中, 分别加入600 mL 95%乙醇，加热回流1.5 h，趁热抽滤，收集滤液，再分别加入300 mL 95%乙醇，再回流30 min，趁热抽滤，收集滤液，合并两次滤液，减压浓缩，浸膏用2%盐酸溶液溶解，定容至300 mL。分别将预处理好的001X7强酸性聚苯乙烯阳离子交换树脂、 D-72强酸性大孔阳离子交换树脂和D-152大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂300 mL装柱（25 mm×600 mm），大约体积为柱子的1/2，先用去离子水不断地冲洗柱子，使树脂之间的空隙减小，冲紧后树脂体积变为柱子的1/3，然后将乙醇提取样品加入到柱子中（BV 300 mL，流速1 BV/h）。待药液上完后，以去离子水3 600 mL洗脱，流速同前，弃去水洗部分，待洗至中性，再以4%的氨水洗脱，流速同上，直至碘化铋钾检识无生物碱沉淀反应后，收集洗脱液并减压浓缩，分别得褐色黏稠浸膏，称重，制得生物碱有效部位。

2.2.2 盐酸回流方法制备有效部位称取厚朴干皮粉末375 g，将药材均匀分配到 3个1 000 mL圆底烧瓶中，用去离子水将浓盐酸稀释成2%的稀盐酸，在每个圆底烧瓶中分别加入 600 mL 2%盐酸，加热回流1.5 h，趁热抽滤，收集滤液，再分别加入 300 mL盐酸，再回流30 min，趁热抽滤，收集滤液，合并两次滤液，得盐酸提取液。阳离子交换树脂处理、上样及洗脱方法同“2.2.1”方法。制得生物碱有效部位。

2.3 厚朴生物碱抗炎活性评价

2.3.1 小鼠耳肿胀试验［7］首先，进行N-降荷叶碱的抗炎活性评价。昆明种小鼠60只，雌雄各半，按性别、体质量随机分为5组，每组12只，即蒸馏水组、阿司匹林组（0.5 g/kg）、N-降荷叶碱高剂量组（40 mg/kg）、中剂量组（20 mg/kg）、低剂量组（10 mg/kg）。小鼠均灌胃给药，给药容量均为每天1次，10 mL/kg，连续给药5 d。末次给药后1 h，每只小鼠左耳廓两面均匀涂抹100% 二甲苯0.05 mL致炎，右耳作对照。30 min后脱颈椎处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用直径8 mm打孔器分别在左右耳的同一部位冲下圆形耳片，电子天平称质量，以两耳片的质量差作为耳肿胀度，计算肿胀抑制率。

其次，厚朴生物碱有效部位样品实验设置八组，即空白组，阳性对照组（阿司匹林组），盐酸提取得到的D-152树脂富集的浸膏组，001X7树脂富集的浸膏组，D-72树脂富集的浸膏组，乙醇提取得到的001X7树脂富集的浸膏组，D-152树脂富集的浸膏组，D-72树脂富集的浸膏组，每组12只，给药方式及耳肿胀度的测定与N-荷叶碱的方法相同，样品组均灌以0.4 mg/（g·mL）。

2.3.2 小鼠足肿胀试验［7］小鼠分组及给药同“2.3.1”方法。于末次给药1 h后，将25 μL 1%（W/V）角叉菜胶分别注射于小鼠右足，左脚不注射作为对照，致炎4 h后，脱颈椎处死，沿着小鼠踝关节剪下小鼠的两足，分别称重，以左右足的重量之差为肿胀度。

肿胀度=右足重（肿胀足）－左足重（对照足）

肿胀抑制率（%）=（对照组平均肿胀度－给药组平均肿胀度）/对照组平均肿胀度×100%。

2.3.3 数据统计分析采用SPSS 22.0软件统计学软件进行处理，实验数据均用（±s）表示，组间比较采用方差分析和t检验。

2.4 分子对接研究

2.4.1 蛋白质及小分子结构准备以N-降荷叶碱为配体，与四个炎症受体进行对接，三维结构数值均来自于国际权威的PDB蛋白质数据库 （http：//www.rcsb.org/pdb），分别为 TNF-α（PDB代码：2AZ5），IL-1β（PDB代码：1RWN），COX-1（PDB代码：1CQE），COX-2（PDB代码：1PXX），利用 Sybyl-x 2.1软件对其进行结构处理。提取复合物中原配体，确定结合位点，除去蛋白质中的水及其他配体，为蛋白质加氢、加电荷，配体模式用于设定对接口袋，保存为SFXC格式作为对接文件，为后续分子对接做准备。N-降荷叶碱的立体结构用 Sybyl-x 2.1软件中的化学结构绘制功能进行绘制，并利用软件对其进行加Gasteiger-huckel电荷、加Tripos力场和能量最小化，进一步用软件设定，保存为Sybyl_mol 2格式文件用于对接［8］。

2.4.2 分子对接打开 Surflex-Dock 模块界面，读入之前准备好的结合口袋SFXC格式文件，设置配体文件为mol 2后读入已准备的N-降荷叶碱配体。对接过程中阈值参数为 0.5，膨胀系数为 1，其他参数为系统缺省值。Surflex-Dock模块采用经验打分函数和专利搜索引擎，得到N-降荷叶碱与上述4个炎症受体的Total score值。Total score 值综合考虑了极性作用、疏水作用、焓和溶剂化等因素，Total score 值越大，表明配体与受体结合力越强、结合活性越高［9］。

3 实验结果

3.1 厚朴总生物碱提取率的结果

分别将乙醇回流和盐酸回流得到的提取物，利用3种不同型号的离子交换树脂进行上样、洗脱及减压浓缩，其总生物碱的提取率，见表1。实验结果表明，对于厚朴总生物碱的提取，无论是提取重量还是提取率，采用乙醇回流提取的效果明显比盐酸回流提取的效果好；并且无论是乙醇回流提取法还是盐酸回流提取法，D-72大孔强酸型离子交换树脂的提取率和提取重量都最高，001X7聚苯乙烯型离子交换树脂的提取效果次之，而D-152丙烯酸型离子交换树脂的提取效果最差。乙醇回流提取的D-72大孔强酸型离子交换树脂的提取重量和提取率分别达到 10.86 g 和 8.69%。

表1 不同提取方法生物碱提取率的比较

3.2 厚朴生物碱有效部位含量测定结果

精密称取以上方法提得的6份生物碱有效部位各0.1 g, 置100 mL容量瓶中，加流动相定容至刻度，即为供试品溶液。在“2.1.2”条件下，分别测定其峰面积，每个样品平行测定3次，求平均值，根据线性方程计算各供试品溶液中N-降荷叶碱单体的含量。依据质量浓度，再分别计算各供试品溶液中N-降荷叶碱单体的质量占生物碱有效部位的百分比。见表2。

表2 不同提取方法N-降荷叶碱占生物碱的比例 %

实验结果表明，对于以上6份生物碱中N-降荷叶碱单体的含量测定，3种离子交换树脂的乙醇回流提取法有效部位百分比都比盐酸回流提取法的有效部位百分比高。并且对于3种离子交换树脂的乙醇回流提取法，001X7聚苯乙烯型离子交换树脂提取得到的生物碱中N-降荷叶碱所占百分比和原药材中N-降荷叶碱所占百分比都最高，分别为15.804%和1.168%；D-152丙烯酸型离子交换树脂提取得到的生物碱中N-降荷叶碱所占百分比次之，为5.146%，但是原药材中N-降荷叶碱所占百分比最少，仅为0.189%；而D-72大孔强酸型离子交换树脂提取得到的生物碱中N-降荷叶碱所占百分比最少，为3.683%，但是原药材中N-降荷叶碱所占百分比却比D-152丙烯酸型离子交换树脂提取的原药材中N-降荷叶碱所占百分比多，为0.320%。

3.3 厚朴生物碱抗炎活性评价

3.3.1 N-降荷叶碱的抗炎活性小鼠耳肿胀试验：结果显示，与蒸馏水相比，高、低剂量组对二甲苯所致的小鼠耳肿胀均有明显的抑制作用（P＜0.01）。与阿司匹林组相比，高、低剂量组无显著差异（P＞0.05），高、低剂量组与中剂量组相比有显著差异（P＜0.01），显示高、低剂量组的炎症抑制作用明显比中剂量组强。见表3。

表3 N-降荷叶碱对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（ ±s， n=12）

表3 N-降荷叶碱对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（ ±s， n=12）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与阿司匹林组比较，##P＜0.01。

组别 剂量/（mg·kg-1）耳肿胀度/mg 肿胀抑制率/% 空白对照组 — 6.48±1.72 — 阿司匹林组 0.50 2.56±2.04** 60.49 N-降荷叶碱高剂量 0.04 2.72±1.68** 58.02 N-降荷叶碱中剂量 0.02 5.62±2.78## 13.27 N-降荷叶碱低剂量 0.01 3.17±1.59** 51.08

小鼠足肿胀试验：结果显示，与蒸馏水相比，高、中、低剂量组对角叉菜胶所致的小鼠足肿胀均有明显的抑制作用（P＜0.01，P＜0.05)。与阿司匹林组相比，高、低剂量组无显著差异（P＞0.05），N-降荷叶碱高、低剂量组具有明显炎症抑制作用。见表4。

表4 N-降荷叶碱对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响（ ±s, n=12）

表4 N-降荷叶碱对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响（ ±s, n=12）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与阿司匹林组比较，#P＜0.05。

组别 剂量/（mg·kg-1）足肿胀度/mg 肿胀抑制率/% 空白对照组 — 10.14±0.27 — 阿司匹林组 0.5 4.47±0.68** 55.92 N-降荷叶碱高剂量 0.04 4.87±1.06** 51.97 N-降荷叶碱中剂量 0.02 6.45±1.87*# 36.39 N-降荷叶碱低剂量 0.01 5.66±1.43** 44.18

3.3.2 厚朴生物碱有效部位的抗炎活性小鼠耳肿胀试验：结果表明与空白组比较，不同方法提取所得的厚朴总生物碱对二甲苯致小鼠耳廓肿胀均有一定的抑制作用，其中，乙醇D-152丙烯酸组、乙醇001X7聚苯乙烯组和乙醇D-72大孔强酸组小鼠耳肿胀度均明显降低，具有显著性差异（P＜0.01），说明用乙醇提取得的抗炎效果更佳。乙醇D-152丙烯酸组、乙醇001X7聚苯乙烯组和乙醇D-72大孔强酸组的肿胀抑制率分别为 61.93%、60.60%和56.38%，即乙醇D-152丙烯酸组抗炎作用最强，其次是乙醇001X7聚苯乙烯组。与空白对照组比较，阿司匹林组具有显著差异（P＜0.01）。另一方面，与阿司匹林组相比，乙醇D-152丙烯酸组、乙醇001X7聚苯乙烯组和乙醇D-72大孔强酸组无显著性差异（P＞0.05），而盐酸D-152丙烯酸组、盐酸001X7聚苯乙烯组和盐酸D-72大孔强酸组存在显著性差异（P＜0.05）。见表5。

表5 厚朴生物碱对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（ ±s，n=12）

表5 厚朴生物碱对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（ ±s，n=12）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与阿司匹林组比较，#P＜0.05。

组别 剂量/（mg·kg-1）耳肿胀度/mg肿胀抑制率/%空白对照组 — 9.01±1.75 —阿司匹林组 0.50 3.70±0.93** 58.93乙醇D-152丙烯酸组 0.04 3.43±0.31** 61.93乙醇001X7聚苯乙烯组 0.04 3.55±0.61** 60.60乙醇D-72大孔强酸组 0.04 3.93±0.31** 56.38盐酸D-152丙烯酸组 0.04 5.37±2.04**# 40.40盐酸001X7聚苯乙烯组 0.04 5.83±1.09*# 35.29盐酸D-72大孔强酸组 0.04 5.53±1.56**# 38.62

小鼠足肿胀试验：结果表明，与空白对照组比较，不同方法提取所得的厚朴总生物碱对角叉菜胶致小鼠足趾肿胀均有一定的抑制作用，且均具有极显著性差异（P＜0.01），说明不同提取工艺所得的厚朴总生物碱都可以降低角叉菜胶致小鼠足趾的肿胀，且乙醇D-152丙烯酸组作用最强，其次是乙醇001X7聚苯乙烯组，第三是乙醇D-72大孔强酸组，盐酸组也显示一定的抑制作用，但总体来说都小于乙醇提取组，说明用乙醇提取得到的总生物碱抗炎效果更佳。与阿司匹林组比较，盐酸D-72大孔强酸组、乙醇回流D-152丙烯酸组，不存在显著性差异（P＞0.05）；而乙醇D-152丙烯酸组、盐酸D-72大孔强酸组，盐酸001X7聚苯乙烯组，盐酸D-152丙烯酸组相比，均存在显著性差异（P＜0.05）。见表6。

表6 厚朴生物碱角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响（ ±s，n=12）

表6 厚朴生物碱角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响（ ±s，n=12）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与阿司匹林组比较，#P＜0.05。

组别 剂量/ （mg·kg-1）足肿胀度/mg肿胀抑制率/%空白对照组 — 11.70±0.31 —阿司匹林组 0.50 4.20±1.62**# 64.10乙醇D-152丙烯酸组 0.04 3.62±1.26** 69.06乙醇001X7聚苯乙烯组 0.04 3.90±0.06** 66.67乙醇D-72大孔强酸组 0.04 4.19±0.10** 64.19盐酸D-152丙烯酸组 0.04 5.92±0.33**# 49.96盐酸001X7聚苯乙烯组 0.04 5.83±0.75**# 50.17盐酸D-72大孔强酸组 0.04 6.28±0.27*# 46.32

3.4 分子对接结果

N-降荷叶碱与TNF-α、IL-1β、COX-1、COX-2等4种炎症受体分子对接的结果见表7，结合模式见图2。结果显示，N-降荷叶碱与TNF-α残基TYR151形成1个氢键，分值为4.808 6，与IL-1β残基GLU355和ARG383形成3个氢键，分值为4.494 6，与COX-1残基TYR358和HIS386形成2个氢键，分值为5.485 9，与COX-2残基GLN203形成1个氢键，分值为4.823 3。以上结果说明N-降荷叶碱可与四种炎症受体较好的结合，与其小鼠炎症实验结果相吻合。

表7 N-降荷叶碱与4种炎症相关受体的分子对接结果

图2 N-降荷叶碱与TNF-α（A），IL-1β（B），COX-1（C），COX-2（D）炎症受体分子对接模式

4 讨论

生物碱是中药厚朴具有代表性的活性成分类型之一，已从中分离到多种生物碱成分［10］，而N-降荷叶碱在厚朴中含量较高，是厚朴表现各种药理作用的物质基础之一，其本身也表现出多种生物活性［11-12］，本实验选择N-降荷叶碱作为分析对象，分别选用了2%盐酸、95%乙醇加热回流进行厚朴生物碱的提取，并利用三种阳离子交换树脂法纯化生物碱类成分，得到生物碱有效部位［10-11］。综合分析实验结果，无论是提取重量还是提取率，采用乙醇回流提取的效果明显比盐酸回流提取的效果好，D-72大孔强酸型离子交换树脂的提取率和提取重量都最好，001X7聚苯乙烯型离子交换树脂的提取效果次之，而D-152丙烯酸型离子交换树脂的提取效果最差。乙醇回流提取的D-72大孔强酸型离子交换树脂的提取重量和提取率分别为10.86 g 和 8.69%，出现这种现象的原因可能是厚朴中的生物碱碱性较弱，在酸水中溶解度小，而用乙醇提取效率更高。本实验采用高效液相色谱法，也能很好地反映厚朴生物碱提取率及N-降荷叶碱的含量。

本实验以N-降荷叶碱为测定对象，通过盐酸和乙醇作为提取溶剂，结合三种离子交换树脂，得到生物碱有效部位，利用二甲苯致小鼠耳肿胀、角叉菜胶致小鼠足肿胀模型，对N-降荷叶碱单体及生物碱有效部位进行了抗炎活性评价。本研究的实验结果也证实了在两种炎症模型上阳性对照组明显高于空白组，N-降荷叶碱单体及有效部位都表现出了明显的抗炎活性，尤其是乙醇作为溶剂得到的生物碱具有更好的抗炎活性，可能与用乙醇作为溶剂提取效率较高有关。

炎症是一种临床中最常见的病症，是动物机体对致炎因子的损伤所发生的一种以防御为主、损伤和抗损伤同时存在的病理过程［13］。据流行病学和临床资料显示，多数疾病的发生、发展过程中都伴随着炎症反应，炎症还能加速疾病的发展。巨噬细胞被各种致炎因子激活后可以产生一氧化氮（NO）和1L-1β、1L-6、TNF-α等炎症因子，在炎症发生发展中有着重要的作用［14］。

分子对接方法在药物研究领域发挥了重要作用，为先导化合物的发现和优化提供了有效的工具［15］。为了进一步探究生物碱发挥活性的药效机制，探究生物碱与靶标的结合情况及作用机制，基于Sybyl分子对接软件，采用特征性的经验打分函数和搜索引擎（基于分子相似性），将配体分子N-降荷叶碱对接到TNF-α、IL-1β、COX-1、COX-2等4种炎症受体分子蛋白的结合位点，Total score大于4以上，说明N-降荷叶碱可与四种炎症受体能较好的结合，从而抑制其作用，产生药效。分子对接结果进一步证实厚朴生物碱抗炎机制与不同程度地抑制炎性介质 TNF-α、IL-1β、COX-1、COX-2产生和释放有关，也与生物碱对小鼠炎症实验结果相吻合。

本研究以高效液相色谱法测定厚朴中N-降荷叶碱的含量，建立了含量测定方法，分析方法准确、简便、重复性好，可作为厚朴生物碱成分的检测方法。N-降荷叶碱单体及其生物碱有效部位都可在一定程度上抑制小鼠的炎症，表明厚朴生物碱类成分有一定的抗炎作用，并且采用乙醇加热回流提取效果更好；N-降荷叶碱分子对接结果与小鼠抗炎实验结果相吻合。目前的研究成果为中药厚朴生物碱的综合利用和深入开发提供了参考依据。