油用牡丹根际解有机磷细菌的筛选及解磷功能研究

沈佳佳 侯小改 王二强 王菲 郭丽丽

（1. 河南科技大学农学院/牡丹学院，洛阳 471023；2. 洛阳农林科学院，洛阳 471022；3. 河南科技学院资源与环境学院，新乡 453003）

在植物生长发育过程中，磷是一种必需的营养元素，它以多种方式参与植物体内的生长代谢过程，例如光合作用、糖类代谢、脂类代谢，同时还是DNA、RNA、ATP、磷脂等必需大分子的组成成分［1］。土壤中的磷主要以无机和有机形式存在［2］，但是由于受到土壤性质的影响，通常大部分会与Ca2+、Mg2+、Al3+、Fe3+、Fe2+等金属阳离子结合，形成难溶性磷酸盐沉积在土壤中［3-5］，不能被植株吸收利用，使得大多数农业土壤缺磷，因而需要施用更多的磷肥来维持作物生产。但是过量施用磷肥，不仅造成磷资源浪费，还会引起水体富营养化、土壤结构被破坏等问题［6-7］。

许多研究表明，自然界中存在一些特定的微生物，能够通过自身代谢等方式将土壤中被固定的难溶性磷转化为植物可吸收利用的有效磷，这些微生物被称为解磷微生物（PSM）［8-9］。这些解磷微生物一方面可以分泌质子和有机酸，从而降低土壤介质的酸碱度或通过羟基和羧基与铁、铝、镁、钙等金属阳离子螯合，使难溶性无机磷酸盐中的磷得以释放出来［10］，另一方面也可以通过分泌磷酸酶来矿化有机磷［2］。从有机和无机难溶性磷酸盐中释放出的磷又重新参与到土壤-植物体的磷循环过程中，增加了有效磷含量，从而促进植物生长［11］。大量研究也已证实将解磷微生物制成菌剂在农田中施用，能在不增加土壤磷库的情况下为植物提供更多的磷元素［12-13］。因此，利用土壤中的解磷微生物来提高土壤磷的利用率对磷肥减施增效、生态环境保护和农业绿色发展具有重要意义。

牡丹属于芍药科芍药属牡丹组木本植物，种类众多，花色变异丰富，在我国已有上千年的栽培历史，是我国的候选国花，具有较高的观赏价值。牡丹根皮（丹皮）是传统的中药材，药用价值也非常可观。油用牡丹结实能力强，牡丹种籽可用来生产牡丹籽油，牡丹籽油富含亚麻酸等不饱和脂肪酸，同时含有白藜芦醇等药用成分，具有降血脂、改善神经功能、抑制癌细胞等功效［14-17］。油用牡丹是集观赏、药用和油用价值于一身的优质花卉品种。已有田间试验表明，不施磷肥显著降低油用牡丹‘凤丹’的干籽的出仁率、种仁含油率和产油量［18］，进而影响其食用品质。因此，高效解磷细菌筛选及应用对增加土壤中有效磷含量以及提高油用牡丹的产量和品质具有重要意义。

目前解磷细菌的分离筛选研究主要集中在解无机磷细菌上［3-4］，而土壤中的有机磷占全磷的29%-90%，植酸盐是土壤有机磷的主要存在形式［19］。土壤有机磷通过解磷细菌的酶解作用可转化成植物能够吸收利用的无机磷［20］。本研究将植酸钙作为唯一磷源，以不同生长年限的油用牡丹‘凤丹’为研究对象，通过平板稀释法从根际土壤中分离筛选具有解磷能力的细菌，以期筛选出具有高效解磷功能的菌株，进而利用其改善油用牡丹的磷营养状况，提高其产量和品质，同时也为微生物菌肥的开发和研制提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 根际土壤的采集与处理 在河南省洛阳市河南科技大学开元校区试验农场（112°24′52.05″E，34°35′45.91″N）采集一、三、四年生油用牡丹（‘凤丹’）根际土壤。去除表层可见的植物残体，采用五点取样法，在距离植株10 cm处利用土钻收集根际土壤，装入无菌袋中，放于4℃冰盒内并带回实验室。到达实验室后将5个样点的根际土壤混匀并过筛（2 mm），采用四分法收集约100 g的根际土壤放入样品袋中，置于4℃冰箱中保存。

1.1.2 培养基的配制 有机磷培养基参考国际植物研究所磷酸盐生长培养基（NBRIP）［21］，成分稍作调整（g/L）：葡萄糖 10，氯化镁 5，植酸钙 2，硫酸镁 0.25，氯化钾 0.2，硫酸铵 0.1，琼脂粉 15，液体培养基则不加琼脂粉。LB液体培养基成分和用量如下（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母粉 5，氯化钠 10。所有培养基pH调至7.0，使用前在121℃下灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 解磷细菌的分离和纯化 利用平板稀释法对牡丹根际土壤中的解磷细菌进行分离筛选［22］。具体操作如下：在超净工作台中称取新鲜土壤样品5 g于无菌离心管中，用无菌水定容至50 mL，振荡20 min，得到土壤悬液，用移液枪吸取10-4、10-5、10-6三个稀释梯度的土壤悬液样品各0.1 mL，均匀涂布于有机磷固体培养基上，每个梯度重复3次，最后在28℃恒温箱中倒置培养并观察平板中菌落生长状况及透明圈的产生情况。用接种环挑取具有溶磷圈且未发生重叠的菌落，在新的有机磷固体培养基上按照Z字形划线纯化，28℃恒温箱中倒置培养，直至得到纯菌株，然后置于4℃冰箱中保存。

1.2.2 菌株鉴定

1.2.2.1 细菌基因组DNA的提取、扩增和纯化 采用AxyPrep 细菌基因组DNA小量制备试剂盒（Axygen，USA）提取细菌的基因组DNA。利用细菌通用引 物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）对基因组DNA进行扩增［23］，PCR扩增反应体系（50 μL）如下：10×Buffer（含2.5 mmol/L Mg2+）5.0，Taq聚合 酶（5 U/μL）1.0，dNTPs（10 μmol/L）1.0，27F引物（10 μmol/L）1.5，1492R引物（10 μmol/L）1.5，基因组DNA（20 ng/μL）1.0，ddH2O 39。PCR反应程序为95℃预变性5 min；35个循环：95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s；最后72℃延伸7 min。取3 μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测并确认PCR扩增片段。PCR产物使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收。

1.2.2.2 序列测定及分析 纯化后的PCR产物送往上海派森诺生物科技股份有限公司，利用测序仪ABI3730-XL进行双向测序。所得序列用ChromasPro软件截去无用序列后，利用BioEdit软件对双端有效序列进行拼接，然后将合格序列在NCBI 数据库中利用Blast程序，与数据库中的序列进行比对，获得与待测菌株序列相似性最大的菌株信息，即为鉴定结果，并将序列上传至GenBank数据库中获得序列号。然后利用MEGA7.0软件［24］对所获得的菌株序列以及与其相似性较高的16S rRNA基因序列进行排列并采用Neighbor-joining方法［25］构建系统进化树。

1.2.3 菌株解磷能力的鉴定

1.2.3.1 溶磷圈的测定 磷酸盐的溶解一般根据培养基上的溶磷圈大小进行初步的定性分析。将分离纯化得到的菌株分别点接于有机磷固体培养基上，置于28℃恒温箱中倒置培养3 d，观察溶磷圈产生情况，并选取多个互相垂直的方向分别测量溶磷圈直径（D）和菌落直径（d），并利用以下公式计算溶磷指数（P solubilization index，PSI）和溶磷效率（P solubilization efficiency，PSE）［26］：

1.2.3.2 解磷能力的定量分析 将筛选得到的菌株接种于LB液体培养中，于37℃、180 r/min振荡培养20 h，测量菌液的OD值，使其OD值为0.6，然后在5 000 r/min下离心3 min，弃上清液后，用0.85%的NaCl溶液清洗菌体3次，再用0.85%的NaCl溶液定容至15 mL，充分摇匀后吸取1 mL加到有机磷液体培养基中，每个菌株重复3次，于37℃、180 r/min振荡培养12 h，随后摇匀并吸取1.5 mL菌液于1.5 mL无菌离心管中，12 000×g离心2 min，吸取1 mL上清液作为待测液，采用钼锑抗比色法测定培养液中速效磷的含量［27］。

1.2.4 数据统计 采用Excel软件对数据进行整理，并计算平均值和标准误差，采用SPSS 26.0 统计软件对数据进行单因素方差分析，通过新复极差法（Duncan）来比较差异的显著性（P ＜ 0.05），最后用Excel软件绘图。

2 结果

2.1 解磷细菌的分子鉴定结果

利用平板稀释法从3个不同生长年限的油用牡丹根际土壤中共筛选获得66株解磷细菌，通过分子鉴定后将其序列与GenBank（核酸序列数据库）中的已有序列进行比对，共得到14株不同的菌株（表1）。其中从1年生油用牡丹根际筛选出2株解磷菌株（编号为FD1-3、FD1-15），3年生油用牡丹根际筛选出7株解磷菌株（编号为FD3-1、FD3-5、FD3-6、FD3-7、FD3-13、FD3-23、FD3-24），4年生油用牡丹根际筛选出5株解磷菌株（编号为FD4-4、FD4-8、FD4-13、FD4-17、FD4-19），将这些菌株的16S rRNA基因序列提交至GenBank中获得的序列号为MW085004-MW085017。在这14株解磷菌株中，隶属于芽孢杆菌属和假单胞菌属的各有5株，各占总菌株数的35.72%；隶属于节杆菌属的有3株，占21.42%；还有1株隶属于新鞘氨醇杆菌属， 占7.14%。

表1 不同生长年限油用牡丹根际解有机磷菌株的基本信息Table 1 Basic information of organic phosphate-solubilizing bacteria isolated from the rhizosphere of P. ostii growing for different years

不同年限油用牡丹根际筛选出的解磷菌株也不尽相同，其中不同生长年限共有的菌株是Bacillus aryabhattai，1年生和3年生油用牡丹根际共有的菌株是Bacillus megaterium，3年生和4年生油用牡丹根际共有的菌株是Pseudomonas mandelii和Pseudomonas frederiksbergensis。

将筛选获得的14株解磷菌株的16S rDNA序列与GenBank中的序列比对同源性高的模式菌株序列构建系统进化树（图1），发现14个菌株可以归为4个主要的菌属（Pseudomonas、Novosphingobium、Bacillus和Arthrobacter）。其中菌株FD3-5、FD3-24、FD4-4、FD4-8和FD4-13与多个Pseudomonas sp.菌株聚为一支，表明这5个菌株与假单胞菌属的亲缘关系更近；菌株FD4-17与新鞘氨醇杆菌属的Novosphingobium gossypii聚为一支，表明二者之间有较近的亲缘关系；菌株FD1-3、FD1-15、FD3-1、FD3-13和FD4-19与2个Bacillus sp.菌株聚为一支，表明这5个菌株与芽孢杆菌属有较近的亲缘关系；菌株FD3-6、FD3-7和FD3-23分别与Arthrobacter属的其中一种聚为一小支，表明这3个菌株与节杆菌属的关系更近。

图1 基于16S rDNA序列构建的解有机磷菌株系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of organic phosphate-solubilizing bacteria based on 16S rDNA sequence

2.2 菌株解磷能力的定性分析

根据解磷细菌在有机磷培养基形成的溶磷圈大小，可直观判断菌株解磷能力（图2）。另外，由解磷细菌在固体培养基上形成的溶磷圈直径（D）和菌落直径（d）计算得到的溶磷指数（PSI）和溶磷效率（PSE）可以作为初步定性评判菌株解磷能力的指标。结果（表2）显示，从1年生油用牡丹根际土壤周围筛选到的菌株FD1-15的溶磷指数和溶磷效率均最高，表明该菌株的解磷能力可能最强。菌株FD1-3、FD3-13和FD4-8的溶磷指数和溶磷效率相等并仅次于菌株FD1-15，表明这3个菌株可能具有较高的解磷能力；菌株FD3-6的溶磷指数和溶磷效率均最低，表明该菌株的解磷能力可能最低。

表2 溶磷圈法分析菌株解磷能力Table 2 Phosphate-solubilizing capacityies of strains analyzed by phosphate-solubilizing circle method

图2 解有机磷细菌在有机磷培养基上形成的溶磷圈Fig.2 Phosphate-solubilizing circles formed by organic phosphate-solubilizing bacteria growing on organophosphate culture media

2.3 菌株解磷能力的定量分析

基于培养液中可溶性磷含量可以判断菌株的解磷能力。本研究从不同生长年限油用牡丹根际土壤中筛选出的14株解磷菌株对应的培养液中速效磷含量在2.88-5.30 mg/L之间（图3），其中从3年生油用牡丹根际土壤中分离筛选的菌株FD3-13对应的培养液中速效磷含量最高，为5.30 mg/L，与菌株FD3-23以及4年生油用牡丹根际土壤中筛选出的菌株FD4-8对应的培养液中速效磷含量无显著性差异，而与其他菌株之间呈现显著性差异；从4年生油用牡丹根际土壤中筛选出的菌株FD4-13对应的培养液中速效磷含量最低，只有2.88 mg/L，与菌株FD4-19、1年生油用牡丹根际土壤中筛选出的菌株FD1-3、3年生油用牡丹根际土壤中筛选出的菌株FD3-1、FD3-7和FD3-24对应的培养液中速效磷含量不存在显著差异，而与其他菌株之间的差异均达到显著水平。

图3 不同生长年限油用牡丹根际解有机磷菌株的解磷能力比较Fig.3 Comparison of phosphate-solubilizing capacities of phosphate-solubilizing strains in the rhizosphere of P. ostii growing for different years

2.4 解磷菌株对植酸钙的活化

根据菌株对植酸钙活化率的高低可以判断菌株解磷能力的强弱。本实验从不同生长年限油用牡丹根际土壤中筛选出的14株解磷菌株对植酸钙的活化率在26.44%-62.13%之间（图4），其中从3年生油用牡丹根际土壤中分离筛选出的菌株FD3-13对植酸钙的活化率最高，为62.13%，与菌株FD3-1、FD3-7、FD3-24，1年生油用牡丹根际土壤中筛选出的菌株FD1-3以及4年生油用牡丹根际土壤中筛选出的菌株FD4-13和FD4-19对植酸钙的活化率存在显著差异，而与其余各菌株之间并未呈现出显著的差异性；从4年生油用牡丹根际土壤中筛选出的菌株FD4-13对植酸钙的活化率最低，只有26.44%，与1年生油用牡丹根际土壤中筛选出的菌株FD1-3以及3年生油用牡丹根际土壤中筛选出的菌株FD3-1对植酸钙的活化率不存在显著性差异，但与其余各菌株之间的差异已达到显著水平。

图4 不同生长年限油用牡丹根际解有机磷菌株活化植酸钙能力的分析Fig.4 Analysis of the capacities to mineralize phytin by phosphate-solubilizing strains in the rhizosphere of P. ostii with different years’ seedlings

3 讨论

研究发现，微生物群落结构会受到植物年龄的影响［28］。牡丹品种和种植年限均能够影响根际微生物的群落结构，并且种植年限对微生物群落结构的影响大于品种对其的影响。牡丹种植年限越长，其根际土壤中细菌和真菌群落结构多样性水平就越低［29-31］。但是，微生物种群和生物量在最开始种植的几年里是随着种植年限的增加而增加的，在种植若干年后其微生物种群和生物量才开始减少。本研究从一、三、四年生油用牡丹根际土壤中共分离到14株解有机磷菌株，其中从3年生油用牡丹根际土壤中分离出的解磷菌株最多，为7株，占总菌株的50%；4年生油用牡丹根际土壤中分离出5株解磷菌株，占35.72%；1年生油用牡丹根际土壤中分离出的解磷菌株最少，只有2株，占14.28%。此外，菌株FD1-3、FD1-15、FD3-1、FD3-13和FD4-19同属于芽孢杆菌属，菌株FD3-5、FD3-24、FD4-4、FD4-8和FD4-13同属于假单胞菌属。Bacillus aryabhattai是从3个不同生长年限油用牡丹根际都能筛选出的解磷菌株，Bacillus megaterium是从1年生和3年生油用牡丹根际都能筛选出的解磷菌株，Pseudomonas mandelii和Pseudomonas frederiksbergensis是从3年生和4年生油用牡丹根际筛选出的解磷菌株，表明芽孢杆菌属和假单胞菌属的细菌是优势菌群，且适应不同生长环境的能力较强。

许多研究发现芽孢杆菌属、假单胞菌属和节杆菌属中一些菌株的溶磷能力较强［32-34］。根据固体培养基上溶磷圈的大小和培养液中速效磷含量的多少以及植酸钙活化率的高低，可以判断菌株的解磷能力。在本研究中，根据溶磷指数（PSI）和溶磷效率（PSE）的结果发现，发现1年生油用牡丹根际筛选到的菌株FD1-15的溶磷指数和溶磷效率均最高，菌株FD1-3、FD3-13和FD4-8的溶磷指数和溶磷效率相等并仅次于菌株FD1-15，表明这4个菌株的解磷能力较强，而菌株FD3-6的溶磷指数和溶磷效率均最低，表明该菌株的解磷能力最低。但是根据培养液中速效磷的含量可以看出解磷能力最强的是从3年生油用牡丹根际土壤中筛选出的菌株FD3-13（巨大芽孢杆菌），属于芽孢杆菌属；解磷能力最弱的为4年生油用牡丹根际土壤中筛选出的菌株FD4-13，属于假单胞菌属。综合上述指标的分析发现，同一菌株在固体培养基和液体培养基中的解磷能力并未达到统一，即在固体培养基上溶磷指数和溶磷效率较小或较大的菌株，在液体培养基中却有较强或较弱的解磷能力，这可能是由两种培养方式不同所造成的，有的解磷细菌可能更适合在液体培养方式下生长繁殖，而在固体培养方式下生长速度较慢，因此菌株在液体培养方式下的解磷能力比在固体培养方式下强［35］，同时也支持了菌株溶磷能力与平板上的溶磷圈大小呈弱相关关系［36］的结论。

有些解磷细菌在固体培养基上溶磷圈不明显，但经过液体培养，也能表现出一定的解磷能力。从1年生油用牡丹根际土壤中筛选出的菌株FD1-3和FD1-15虽同为芽孢杆菌属，但在溶解植酸钙的能力上也存在显著差异，这可能与菌株本身的性质有关，同一属的菌株其溶磷能力也可能存在较大差异［37］。若能将筛选到的高效解磷菌株进行规模化扩繁和驯化，并开发和研制成微生物菌肥应用到油用牡丹的栽培中，不仅对提高油用牡丹的产量和品质具有重要意义，同时对产业的发展也起到一定的推动作用。

4 结论

从一、三、四年生油用牡丹根际土壤中共筛选出14株解有机磷菌株。其中隶属于芽孢杆菌属和假单胞菌属的各5株，隶属于节杆菌属的3株，隶属于新鞘氨醇杆菌属1株；解有机磷菌株溶磷指数和溶磷效率分别在1.6-9.0和60%-800%之间，其中1年生油用牡丹根际筛选到的菌株FD1-15的溶磷指数和溶磷效率均最高；培养液中速效磷含量为2.88-5.30 mg/L，活化率在26.44%-62.13%之间，解磷能力和活化能力最强的是从3年生油用牡丹根际筛选获得的菌株FD3-13，隶属于芽孢杆菌属。