单细胞拉曼光谱在环境解磷微生物中的应用研究

林绍敏，李弘哲，崔 丽

（1. 中国科学院城市环境研究所 中科院城市环境与健康重点实验室，福建 厦门 361021；2. 福建农林大学 生命科学学院，福建 福州 350000）

0 引言

磷是农业生产中必需的营养元素之一，是植物组织和细胞组成的重要元素，参与作物生长过程中的一系列生理生化过程。磷素的缺乏会导致植株生长缓慢，根系发育不全，降低作物的产量和品质等问题［1］。磷肥是农业生产所需的三大肥料之一，生产磷肥的主要原料来自磷矿石，磷矿石是一种不可再生资源［2］。根据2017 年的统计数据，全球磷肥消耗量约为5 000 万t/a，预计2030 年将增至7 000万t/a，磷素正在快速“消逝”。施用磷肥是土壤磷的主要来源。然而，所施用磷肥会被土壤固定，难以被植物直接吸收利用，造成磷肥利用率低［3］。长期施用磷肥使土壤形成一个巨大的累积态“磷库”，亟须一把合适的“钥匙”开启这个“磷库”，缓解磷资源短缺问题，促进农业生产的可持续发展。

解磷微生物可以通过分泌有机酸（包括葡萄糖酸、草酸、苹果酸、柠檬酸等）降低土壤pH，促进矿质磷的溶解，同时能与Fe3+、Al3+、Ca2+等阳离子螯合，通过与磷酸根离子竞争土壤中相同的吸附位点，释放磷酸根离子［4］。除此以外，解磷微生物还可以通过释放磷酸酶活化土壤有机磷，使固定态磷向生物有效态磷转变［5］。在实际农业生产过程中，施用解磷菌剂可以降低磷肥施用量，促进土壤磷循环。因此，解磷微生物对于土壤磷的生物地球化学循环起着重要作用，对维持土壤生态系统平衡与农业可持续发展具有重要意义［6］。目前，对解磷微生物的获取往往依赖于纯培养技术。然而，超过99%的微生物不可分离纯培养，大量解磷微生物资源未被挖掘和利用［4］。开发一种不依赖纯培养的解磷微生物及其活性检测技术，对解析环境中解磷微生物的群落、功能、活性和代谢通路等具有重要意义。

1 单细胞拉曼光谱解析高活性解磷菌的原理和应用

为了克服纯培养的限制，笔者所在团队近期研发了单细胞拉曼光谱结合重水同位素标记的新技术，实现了土壤中高活性解磷微生物（包括未培养部分）的原位研究［7］。单细胞拉曼光谱可对单个微生物细胞进行检测，无须培养。它可以快速无损地获取细胞内不同生物分子的振动光谱，包括核酸、蛋白质、脂类、色素（如细胞色素c 和类胡萝卜素）和聚合物等［8］。通过这些谱图的变化鉴别微生物细胞的生理性状和应激响应等信息。更重要的是，拉曼光谱还可与13C、15N或2D等稳定同位素标记（SIP）结合，提供真实的微生物功能和代谢活性等信息。它利用活性细胞同化同位素标记底物后，新合成生物分子化学键中的轻原子被重同位素取代，造成化学键振动频率下降，拉曼峰发生偏移。该拉曼峰偏移，可作为微生物功能或活性的标志峰［9］。例如，利用重水同位素标记时，活性微生物同化氘并代替氢进行合成代谢，使得构成生命体的重要生物分子，如脂类、蛋白质、DNA 等被氘化，所产生的新的C—D 键可被拉曼光谱灵敏检测到，并且C—D 峰强度还可反映微生物的新陈代谢活性［10-11］。

对于解磷微生物，也可以利用拉曼光谱结合重水同位素标记技术进行研究。基本原理是：磷素对微生物的活性起着关键作用。仅固定态磷存在条件下，解磷菌可以分解利用难溶性磷，同化重水中氘进行新陈代谢，因此仍具有代谢活性，产生C—D键（特征键）拉曼峰，而非解磷菌无法进行正常的新陈代谢，难以同化氘。因此，通过拉曼光谱中C—D 键拉曼峰的强弱，可快速区别解磷菌和非解磷菌，并根据解磷微生物的代谢活性（即C—D 键拉曼峰强度），反映其解磷能力。另外，由于重水标记不会改变环境的营养底物库，因此，可以在不影响微生物生存环境条件下，真实反映土壤微生物的解磷能力。单细胞水平检测，也能克服纯培养的限制，识别土壤中未培养的解磷微生物。

利用单细胞拉曼光谱分别检测微生物在含有可溶性磷和不含磷培养液中的代谢活性，发现在含磷培养液中，微生物具有明显的C—D 峰；而在不含磷培养液中的微生物没有C—D 峰（见图1），说明磷对微生物活性具有决定性作用。进一步利用难溶磷酸钙（无机磷）和卵磷脂（有机磷）作为唯一的无机或有机磷源，将4 种不同的解磷菌进行孵育。研究结果表明，4种解磷菌的C—D峰强度具有显著差异，且C—D 峰强度与传统方法检测的可溶性磷浓度或酸性磷酸酶活性基本一致（见图2 和图3），说明了单细胞拉曼光谱和重水标记方法研究不同细菌解磷能力的准确性。

图1 4种菌剂在含磷和不含磷的50%重水培养液中孵育24 h后的拉曼光谱

图2 以卵磷脂作为唯一有机固定态磷源培养后磷酸酶活性与C—D峰强度

图3 以磷酸钙为唯一无机固定态磷源培养后可溶性磷浓度与C—D峰强度比值

在此基础上，将该方法从纯菌拓展至复杂的土壤环境。在已去除可溶性磷的土壤中添加重水进行原位孵育，并利用拉曼光谱在单细胞水平检测土壤提取微生物的C—D 峰（见图4）。研究发现，土壤微生物拉曼光谱中存在不同强度的C—D 峰，说明复杂多样的土壤中的微生物具有不同的解磷活性。进一步结合拉曼成像，实现在不依赖纯培养的条件下，识别土壤中的高效解磷微生物（见图5）。I和II分别是利用C—H和C—D拉曼峰进行成像，C—H区分生物和非生物质，C—D 区分解磷菌。可见，含C—H 的微生物明显多于含C—D 的微生物，说明土壤中仅部分菌具有解磷活性。

图4 在无可溶性磷土壤中加入重水孵育24 h后土壤微生物的单细胞拉曼光谱

图5 土壤中提取微生物和少许土壤残留拉曼成像

单细胞拉曼光谱解析土壤高活性解磷菌的关键步骤：首先，受试土壤须去除其中的有效磷，如利用水和NaHCO3进行孵育和离心清洗；其次，在洗去有效磷的土壤中加入一定量的D2O，该同位素标记物是检测微生物解磷能力的必要试剂；再次，利用密度梯度离心法将土壤微生物从土壤中提取分离出来，避免检测时土壤颗粒对微生物的干扰；最后，利用共焦显微拉曼光谱仪对提取的土壤微生物进行单细胞水平检测，并利用拉曼光谱中C—D 峰强度评价解磷能力或活性。

2 传统解磷微生物研究方法与单细胞拉曼光谱方法对比

不同解磷微生物的研究方法均存在优缺点，具体见表1。传统解磷微生物的研究方法，主要是从复杂的生态环境中分离、纯化、培养出解磷微生物，通过研究溶磷量和生长速率表征微生物的解磷能力［12］。另外，由于解磷菌在无机磷溶解过程中会释放无机酸和有机酸，酸化细菌培养基。因此，测定培养基的pH 也可反映微生物的解磷能力［13］。然而，这种依赖分离、纯化、培养解磷微生物进行微生物特征分析的方法受多种因素干扰，部分微生物因为缺乏合适的培养基、培养温度不适宜、自身生长弊端和缺乏共生体等原因无法在培养基中进行纯培养。即使是从复杂环境中提取培养的解磷微生物，也不能全面真实地反映它们在环境中的活动［14］。此外，解磷菌能够释放非特异性酸性磷酸酶和植酸酶，促进有机磷活化，且研究发现各形态磷含量与酶活性显著正相关，尤其是酸性磷酸酶。因此，微生物酶活性也是表征解磷微生物解磷能力的手段之一［15］。但是，由于植物也分泌磷酸酶，干扰微生物解磷活性的测定，且其仅反映有机解磷菌的活性，无法判断无机解磷菌的活性，造成方法具有局限性。除此以外，总碳、总氮等土壤特征与酸性磷酸酶的活性密切相关，也可间接反应微生物的解磷能力［16］。

表1 解磷微生物研究方法对比

不依赖培养的分子生物学技术已被广泛应用于微生物群落结构和功能多样性研究［17］。土壤宏基因组测序可揭示微生物解磷相关的功能基因，功能基因定量PCR（聚合酶链反应）技术可定量微生物解磷相关功能基因丰度［18］。然而，上述技术仅从基因型角度表征解磷微生物的解磷潜力，不能反映微生物真实具有的解磷能力。除此以外，这些方法还具有科研材料费用昂贵、测序和检测过程过于烦琐、耗时长等问题。

相比于解磷菌培养和分子生物学技术，单细胞拉曼光谱-重水同位素标记联用技术克服了解磷微生物纯培养的限制，可直接从土壤环境中寻找解磷菌，并且是具有真实解磷（包括对无机磷与有机磷的溶解）能力的微生物。

3 展望

目前单细胞拉曼光谱结合重水技术已被应用于复杂土壤环境中检测高效解磷菌的研究。在未来工作中，该技术还能够用于评价不同土壤微生物的解磷能力，并逐步发展成衡量土壤健康这一重要指标的依据。同时，单细胞拉曼光谱结合分子生物学手段，还可促进对“以碳促磷”等重要微生物学机制的深入认识；结合转录组和蛋白组等多组学手段，可深入探究解磷微生物在土壤生态系统中响应多级磷素转化的分子调控机制；结合色谱分析，有望更直观探究有机磷农药在土壤生态系统中的迁移和转化。另外，由于拉曼光谱近乎无损检测，结合单细胞分选，还可对拉曼光谱检测的高效解磷菌进行分选、测序，甚至培养，促进新型解磷菌种和新型功能基因的挖掘，以及解磷微生物资源的实际农业利用。

然而，单细胞拉曼光谱目前还无法实现大样本的高通量检测以及便携式的实时快速检测。今后还需发展针对土壤微生物的快速和高通量样品处理方法。另外，由于微生物之间交互饲喂（cross-feeding）对重水标记复杂微生物群落中的解磷微生物的干扰，还需发展合适的重水孵育方式和装置，降低该干扰。此外，还需发展可对微生物进行快速在线检测的便携式拉曼光谱仪，以促进拉曼光谱方法的现场应用。