黄芩苷通过上调miR-1272表达影响肺癌A549细胞恶性生物学行为

2022-07-22潘庆芳刘贵敏田瑞刘艺

广东药科大学学报 2022年4期

潘庆芳，刘贵敏，田瑞，刘艺

（中国人民解放军陆军第82集团军医院1.血液内分泌科；2.检验病理科，河北保定 071000）

肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因[1]。在我国，随着工业发展的加快和生活方式的改变，肺癌发病率、死亡率呈逐年增加趋势，已成为一种严重的健康负担[2]。虽然手术切除对早期肺癌患者有效，但由于癌细胞的异常侵袭转移，术后复发率较高。另外，多数患者确诊时已处于中晚期，放化疗、靶向治疗后预后仍然很差，死亡率高[2]。因此，亟需寻找新的有效的肺癌治疗策略。传统中草药用于癌症辅助治疗已有悠久历史。黄芩苷是从中药黄芩根中分离的一种黄酮类化合物，具有抑菌、抗炎等作用[3]。最近研究表明，黄芩苷还发挥抗肿瘤作用，例如，黄芩苷通过诱导铁蛋白重链1（FTH1）依赖性铁死亡发挥抗膀胱癌活性，有望成为治疗膀胱癌的新型药物[4]；黄芩苷可有效抑制结直肠癌细胞增殖，并诱导结直肠癌细胞凋亡，发挥抗结直肠癌作用[5]。此外，研究显示，黄芩苷抑制体外肺癌细胞恶性行为，发挥抗肺癌作用[6]。但黄芩苷在肺癌中的抗癌作用机制仍不清楚。微小RNA（miRNA）是一类长度仅为18～25 bp的非编码RNA，其参与细胞增殖、凋亡、分化和肿瘤发生等多种生物学过程，在肺癌防治中具有潜在靶点作用[7-8]。miR-1272位于15q22.31，已有研究证实，前列腺癌中miR-1272表达降低，过表达miR-1272可显著降低前列腺癌细胞的生长、迁移和侵袭能力，并提高其放疗敏感性[9]。Lu等[10]通过微列阵分析证实肺癌组织中miR-1272表达降低，但miR-1272在肺癌中的作用、黄芩苷是否通过调控miR-1272表达发挥作用仍需探讨。本研究分析了黄芩苷对肺癌细胞生物学行为的影响，并探讨了miR-1272是否介导黄芩苷的抗肿瘤作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人肺癌细胞A549、人支气管上皮细胞HBE，中国科学院上海细胞库；黄芩苷（质量分数≥98%），上海源叶；miRNA 模拟物（mimics）、抑制物（antimiRNA）及其相应对照（miR-NC、anti-miR-NC），上海吉玛制药公司；细胞计数试剂盒（CCK-8），武汉金开瑞；Transwell小室，美国密理博公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒，上海贝博；兔抗人细胞周期素D1（CyclinD1）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl相关X蛋白（Bax）、p21一抗以及山羊抗兔IgG二抗，上海艾博抗公司；miRNA逆转录试剂盒、通用PCR Master Mix购于美国Thermo Fisher公司。

1.2 细胞培养和实验分组

用含10%（φ）胎牛血清的DMEM培养基置于CO2培养箱中培养A549细胞。用黄芩苷终浓度分别为0、20、40、80 μmol/L的培养液孵育A549细胞24 h，依次记为对照组、黄芩苷低、中、高剂量组，实时定量PCR（RT-qPCR）检测miR-1272表达水平。利用Lipofectamine 2000将miR-NC、miR-1272分别转染A549细胞，记为miR-NC组、miR-1272组。用黄芩苷终浓度为80 μmol/L的培养液孵育转染antimiR-NC、anti-miR-1272的A549细胞24 h，记为高剂量+anti-miR-NC组、高剂量+anti-miR-1272组。

1.3 CCK-8实验检测细胞活力

96孔板中接种转染、未转染的A549细胞（2.5×103个/孔），分组处理后，每孔中加入10 μL的CCK-8试剂。酶标仪测量450 nm处的吸光度值（A）表示细胞活力。

1.4 Transwell检测细胞迁移和侵袭

Transwell实验用于检测A549细胞的迁移（上腔室未包被基质胶）和侵袭（上腔室包被基质胶）能力。每组取200 μL无血清DMEM培养基稀释的细胞悬液（细胞数约为5×103）接种Transwell上腔室，下腔室加入600 μL含10%FBS的完全培养基。在37°C下孵育24 h后，用棉签擦去未穿膜的细胞。甲醇固定膜下表面细胞，并用0.1%的结晶紫染色。显微镜（200×）观察并计数。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

收集各组细胞，用500 μL结合缓冲液重悬，依次加 5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，室温避光染色15 min。流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 Western blot检测蛋白表达

RIPA裂解法对细胞中总蛋白进行提取，经分离、转膜、封闭后，与兔源一抗4℃孵育12 h。洗膜后，与抗兔IgG二抗室温孵育1 h。显影，曝光，以GAPDH为内参，Image J软件分析目的蛋白相对表达量。

1.7 RT-qPCR检测miR-1272表达

miRNeasy Mini试剂盒从各组细胞中分离总RNA，miRNA逆转录试剂盒将其反转录为cDNA，利用通用PCR Master Mix检测miR-1272表达水平，2-ΔΔCt法分析miR-1272相对表达量。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 miR-1272在肺癌A549细胞中的表达

肺癌细胞A549中miR-1272表达水平为0.57±0.03，较人支气管上皮细胞HBE中miR-1272表达水平（1.03±0.03）显著降低（P＜0.05）。

2.2 黄芩苷对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响

与对照组比较，黄芩苷低、中、高剂量组A549细胞活力、迁移和侵袭细胞个数显著降低，凋亡率显著升高，（CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2）蛋白表达降低，（p21、Bax）蛋白表达升高（P＜0.05）。且不同浓度组间各项指标比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1、表2、图1和图2。

图1 黄芩苷对肺癌A549细胞迁移侵袭和凋亡的影响Figure 1 Effects of baicalin on the migration，invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells

图2 黄芩苷对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白表达的影响Figure 2 Effects of baicalin on the expression of proliferation,migration,invasion and apoptosis-related proteins in lung cancer A549 cells

表1 黄芩苷对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响Table 1 Effects of baicalin on the proliferation，migration，invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells（±s，n=9）

与对照组比较：*P＜0.05；与低剂量组比较：#P＜0.05；与中剂量组比较：&P＜0.05。

组别对照组黄芩苷低剂量组中剂量组高剂量组A值1.53±0.05 1.35±0.03*0.94±0.03*#0.49±0.02*#&迁移细胞数/个140.52±9.04 111.21±4.42*93.83±4.26*#62.92±3.52*#&侵袭细胞数/个87.46±3.76 71.95±3.09*52.26±2.52*#30.62±1.81*#&凋亡率/%3.72±0.25 9.91±0.47*19.47±1.21*#31.85±1.84*#&

表2 黄芩苷对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白的影响Table 2 Effects of baicalin on the expression of proliferation,migration,invasion and apoptosis-related proteins in lung cancer A549 cells (±s,n=9)

与对照组比较：*P＜0.05；与低剂量组比较：#P＜0.05；与中剂量组比较：&P＜0.05。

组别对照组黄芩苷低剂量组中剂量组高剂量组CyclinD1蛋白0.85±0.04 0.61±0.03*0.46±0.03*#0.28±0.02*#&p21 0.31±0.02 0.45±0.03*0.63±0.04*#0.79±0.04*#&MMP-2蛋白0.81±0.04 0.65±0.03*0.49±0.03*#0.35±0.02*#&MMP-9蛋白0.69±0.04 0.54±0.03*0.43±0.02*#0.28±0.01*#&Bcl-2蛋白0.74±0.04 0.60±0.03*0.48±0.02*#0.33±0.03*#&Bax蛋白0.23±0.01 0.42±0.03*0.55±0.03*#0.71±0.04*#&

2.3 黄芩苷对肺癌A549细胞中miR-1272的影响

对照组、黄芩苷低、中、高剂量组A549细胞中miR-1272表达水平分别为 1.01±0.03、1.27±0.06、1.87±0.12、2.93±0.19。与对照组比较，低、中、高剂量组A549细胞中miR-1272表达水平显著升高（P＜0.05），且不同浓度组间miR-1272表达比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 过表达miR-1272对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响

与miR-NC组比较，miR-1272组A549细胞活力、迁移和侵袭细胞个数显著降低，凋亡率显著升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达降低，p21、Bax蛋白表达升高（P＜0.05）。见表3、表4、图3和图4。

图3 过表达miR-1272对肺癌A549细胞迁移侵袭和凋亡的影响Figure 3 Effects of miR-1272 overexpression on the migration，invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells

图4 过表达miR-1272对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白表达Figure 4 Effects of miR-1272 overexpressionon the expression of proliferation，migration，invasion and apoptosis-related proteins in lung cancer A549 cells

表3 过表达miR-1272对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响Table 3 Effects of miR-1272 overexpression on the proliferation,migration,invasion and apoptosis of lung cancerA549 cells(±s,n=9)

与miR-NC组比较：*P＜0.05。

组别miR-NC miR-1272 A 1.51±0.08 0.41±0.03*迁移细胞数/个136.71±6.13 58.15±1.81*侵袭细胞数/个89.11±3.41 21.22±0.77*凋亡率/%4.25±0.19 34.59±1.73*

表4 过表达miR-1272对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白的影响Table 4 Effects of miR-1272 overexpression on the expression of proliferation,migration,invasion and apoptosis-related proteins in lung cancer A549 cells(±s,n=9)

与miR-NC组比较：*P＜0.05。

组别miR-NC miR-1272 CyclinD1蛋白0.81±0.05 0.19±0.02*p21 0.34±0.01 0.82±0.04*MMP-2蛋白0.79±0.04 0.31±0.01*MMP-9蛋白0.67±0.04 0.22±0.01*Bcl-2蛋白0.75±0.03 0.28±0.01*Bax蛋白0.23±0.01 0.76±0.05*

2.5 抑制miR-1272表达能逆转黄芩苷对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响

与高剂量+anti-miR-NC组比较，高剂量+anti-miR-1272组A549细胞活力、迁移和侵袭细胞个数显著升高，凋亡率显著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达升高，p21和Bax蛋白表达降低（P＜0.05）。见表5、表6、图5和图6。

图5 抑制miR-1272表达能逆转黄芩苷对肺癌A549细胞迁移、侵袭和凋亡的作用Figure 5 Effects of baicalin on the migration，invasion and apoptosis of A549 cells reversed by inhibition of miR-1272 expression

图6 抑制miR-1272表达能逆转黄芩苷对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白表达的作用Figure 6 Effects of baicalin on the expression of proliferation,migration,invasion and apoptosis-related proteins in A549 cells reversed by inhibition of miR-1272

表5 抑制miR-1272表达逆转黄芩苷对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响Table 5 Effects of baicalin on the proliferation,migration,invasion and apoptosis of A549 cells reversed by inhibition of miR-1272(±s,n=9)

与高剂量+anti-miR-NC组比较：*P＜0.05。

组别高剂量+anti-miR-NC高剂量+anti-miR-1272 A450 nm 0.48±0.03 1.43±0.05*迁移细胞数/个62.98±1.47 121.15±4.72*侵袭细胞数/个29.85±0.87 79.62±3.41*凋亡率/%29.25±1.72 7.18±0.50*

表6 抑制miR-1272表达能逆转黄芩苷对肺癌A549细胞增殖、迁移/侵袭和凋亡相关蛋白的影响Table 6 Effects of baicalin on the expression of proliferation,migration,invasion and apoptosis-related proteins in A549 cells reversed by inhibition of miR-1272 (±s,n=9)

与高剂量+anti-miR-NC组比较：*P＜0.05。

Bax蛋白0.72±0.03 0.31±0.01*组别高剂量+anti-miR-NC高剂量+anti-miR-1272 CyclinD1蛋白0.27±0.01 0.75±0.03*p21 0.78±0.03 0.39±0.01*MMP-2蛋白0.34±0.01 0.73±0.03*MMP-9蛋白0.26±0.01 0.61±0.02*Bcl-2蛋白0.30±0.01 0.68±0.03*

3 讨论

大量研究表明，黄芩苷通过调控肿瘤细胞增殖、转移、凋亡和耐药在多种人类癌症中具显著的抗肿瘤作用。Huang等[11]研究指出，黄芩苷通过调控JNK/Foxo1/BIM信号通路可抑制胰腺癌SW1990细胞增殖，诱导细胞凋亡。Gao等[12]研究表明，黄芩苷可阻断核因子-κB（NF-κB）途径诱导G1/S期周期阻滞，抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。此外，Xu等[13]研究证实，黄芩苷通过抑制微管亲和力调节激酶2（MARK2）和蛋白激酶（AKT）活化降低肺癌细胞对顺铂的耐药性。与上述抗肿瘤作用一致，本研究发现黄芩苷以剂量依赖方式抑制肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡。CyclinD1是促进细胞周期从G1期向S期转换的关键蛋白，其过表达可引起细胞异常增殖，从而导致肿瘤发生，而p21则抑制细胞周期进程、DNA复制和修复，具有抗增殖作用[14]。MMPs对肿瘤细胞侵袭、迁移起促进作用，这与其降解细胞外基质和基底膜有关。已有研究证实黄芩苷可显著下调宫颈癌细胞中MMP-2和MMP-9的表达水平，抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭[15]。Bax和Bcl-2在线粒体依赖性细胞凋亡中具有重要作用，Bax表达增加导致细胞色素C释放量增加，激活下游半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）途径具有促凋亡作用，而Bcl-2通过抑制Bax移位至线粒体发挥抗凋亡作用[16]。本研究中，黄芩苷显著降低A549细胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9和Bcl-2表达水平，升高p21和Bax表达水平，与功能分析结果相吻合，这表明黄芩苷可抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，在肺癌中具有抗肿瘤作用。

近年来，多项研究证实黄芩苷通过调控miR表达在多种类型的癌症中发挥抗癌作用。如黄芩苷通过抑制 miR-217、miR-10a、miR-23a、miR-30c、miR-31等致癌miRNAs表达可诱导结肠癌细胞凋亡、抑制肿瘤生长[17-18]。黄芩苷通过上调miR-485-5p的表达抑制前列腺癌细胞的增殖[19]。此外，黄芩苷在乳腺癌中的抗增殖、抗侵袭转移功能也与调控miR-338-3p表达有关[20]。本研究发现肺癌细胞A549中miR-1272表达水平显著降低，转染miR-1272 mimics过表达miR-1272显著抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导A549细胞凋亡，与Rotundo等[9]研究结论一致。此外，黄芩苷处理可显著提高miR-1272表达水平，转染anti-miR-1272抑制miR-1272表达导致黄芩苷对A549细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响降低，提示黄芩苷可能通过上调miR-1272表达在肺癌中发挥抗肿瘤作用。

综上所述，黄芩苷对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭具有显著抑制作用，而对其凋亡起促进作用，可能与其上调了miR-1272表达有关，其丰富了中药化合物和miRNA之间调控关系，为黄芩苷用于治疗肺癌提供了理论依据。