HPLC 法同时测定山慈菇中3 种成分

2022-07-22谢典朱聪潘红波李晓静徐步斌周斌

中成药 2022年6期

谢典朱聪潘红波李晓静徐步斌*周斌*

（1.江西科技师范大学药学院，江西南昌330013； 2.海军勤务学院，天津300450）

山慈菇是兰科植物杜鹃兰Cremastra appendiculata（D.Don）Makino、独蒜兰Pleione bulbocodioides（Franch）Rolef、云南独蒜兰Pleione yunnanensisRolfe 的假鳞茎，秋季采摘，摘弃茎叶洗净泥沙，经晒干或烘干后加工而成。山慈菇分布广泛，在长江以南、西北、西南等地区均有种植。山慈菇具有悠久的应用历史，最初记载于唐代《本草拾遗》，药性甘、微辛、凉，归肝、脾经，有清热解毒、化痰祛瘀的功效，可用于痈肿疔毒、瘰疬痰核等由皮肤炎症或感染引发的外科疾病，蛇虫咬伤等［1］。

从山慈菇中分离得到菲类、联苄类、糖及糖苷类、萜类、甾体类［2-10］等成分。山慈菇具有抗肿瘤［11-17］、降压［18-19］、抗菌［20-23］、抗痛风［24-25］等药理活性。在我国，山慈菇常与其他中药配伍治疗肺癌、肝癌、大肠癌、乳腺癌等恶性肿瘤以及抗痛风治疗。dactylorhin A、militarine、秋水仙碱是山慈菇中主要的活性成分，其中，dactylorhin A、militarine 属于丁二酸苄酯苷类成分，能够提高由于用药导致缺损的老鼠记忆，降低脑部神经损伤，具有延缓衰老和抗老年痴呆的作用［26-28］，秋水仙碱则具有良好的抗痛风、抗肿瘤作用。

近年来，山慈菇的研究聚焦于抗肿瘤作用机制，同时dactylorhin A、militarine 和秋水仙碱的含量测定也分别有报道［29-32］。本研究首次建立HPLC 法同时测定山慈菇中dactylorhin A、militarine、秋水仙碱的含量，以期为山慈菇药材的质量控制与评价提供依据。

1 材料

1.1 仪器 KQ-3200DB 型超声波清洗器（江西赣仪科技有限公司）；LR4000 型旋转蒸发仪（德国Heidolph 公司）；2550 型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；1100 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；CP225D 型电子天平（十万分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；中药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 dactylorhin A 对照品（批号256459-34-4，纯度≥98%，成都植标化纯生物技术有限公司）；militarine（批号DST190724-025，纯度≥98%）、秋水仙碱（批号DST190527-052，纯度≥98%）对照品（成都德思特生物技术有限公司）。山慈菇购自云南省丽江市，由江西中医药大学药学院邓可众副教授鉴定为正品。甲醇（上海晶纯生化科技股份有限公司）；乙腈（汕头市西陇科学股份有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液称取dactylorhin A、militarine、秋水仙碱对照品适量，置于量瓶中，甲醇稀释至刻度，制成质量浓度分别为0.097、1.006、0.541 mg／mL 溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液将药材粉碎，过30 号筛，称取粉末0.5 g，置于50 mL 具塞锥形瓶中，加入70% 甲醇50 mL，静置1 h，超声（100 W，45 kHz）处理1 h，滤过，将滤液浓缩转移至10 mL 量瓶中，定容，摇匀，即得。

2.2 检测波长选择将“2.1.1”项下对照品溶液于200～600 nm 波长范围内扫描，发现dactylorhin A、militarine 最大吸收波长均为224 nm，秋水仙碱最大吸收波长为242 nm，但在224 nm 处也有较好吸收。因此，选择224 nm作为检测波长。

2.3 色谱条件 DIKMA Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～10 min，10% A；10～40 min，10%～40% A；40～45 min，40%～10% A）；体积流量1 mL／min；柱温30 ℃；检测波长224 nm；进样量10 μL。

2.4 专属性试验精密吸取对照品、供试品溶液各10 μL，在“2.3”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分分离度理想，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.5 线性关系考察精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液适量，甲醇定容至刻度，制成系列质量浓度对照品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X）进行回归，并分别以S／N＝3、S／N＝10 计算检测限、定量限，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.6 精密度试验吸取“2.1.1”项下对照品溶液适量（质量浓度分别为dactylorhin A 29.9 μg／mL、militarine 83.5 μg／mL、秋水仙碱34.6 μg／mL），在“2.3”项色谱条件下进样测定6次，测得dactylorhin A、militarine、秋水仙碱峰面积RSD 分别为0.64%、0.28%、0.27%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验精密称取药材粉末0.5 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、6、8、10、24 h 在“2.3”项色谱条件下进样测定，测得dactylorhin A、militarine、秋水仙碱峰面积RSD 分别为0.62%、0.80%、1.04%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8 重复性试验精密称取药材粉末0.5 g，共6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项下色谱条件进样测定，测得dactylorhin A、militarine、秋水仙峰面积RSD 分别为0.66%、0.79%、0.37%，表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验精密称取药材粉末0.25 g，平行6份，按100%水平精密加入对照品溶液适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。2.10 样品含量测定精密称取药材粉末3份，每份0.5 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表2 各成分加样回收率试验结果（n＝6）

表3 各成分含量测定结果（mg／g）

3 讨论

本实验考察不同流动相体系（乙腈-水、甲醇-水）的分离效果，比较超声法、回流法对于成分提取的效果。结果，以甲醇-水为流动相体系所得的目标峰理论塔板数低，militarine、秋水仙碱色谱峰分离度差，且基线不平稳，而乙腈洗脱能力强、黏度低，可以提高色谱峰理论塔板数，使出峰提前，有效缩短进样检测时间，故选择以乙腈-水为流动相，经过不断调整洗脱梯度，使得3 个目标峰有较好的分离度。同时，进行超声和回流提取方式的比较，测得两者相差不大，超声提取简便、易操作、适用于多批次样品提取，故选取超声为提取方法。以乙腈-水为流动相对3 种成分进行分离和含量测定，表明该方法具有较好的准确性、精密度和重复性。