HPLC 法同时测定复方疮疡搽剂中7 种成分

曹贺龚雪姬生国

（1.广东药科大学，广东 广州510006； 2.广州大学城健康产业科技园投资管理有限公司，广东 广州510006）

复方疮疡搽剂为老中医经验方，由金银花、大黄、黄柏、当归等中药组成［1］，方中金银花为君药［2］，以其甘、寒之性起清热解毒、散痈消肿之效［3］；大黄、当归为臣药［4］，起凉血解毒、逐淤通经、活血止痛之效［5］；佐以五倍子、乌梅，以达敛疮止血之效［6-7］，诸药配伍，共奏散瘀消肿，托毒生肌、抗菌消炎、敛疮作用［8］，用于治疗外伤、疮疡、甲沟炎、口腔溃疡［9-11］、糖尿病足溃疡［12-13］等病症。前期对复方疮疡搽剂制备工艺进行优化［14］，最终确定为金银花、当归用水蒸气蒸馏法收集芳香水［15］，药渣同其余药材一同煎煮2次，合并煎煮液，浓缩后回收乙醇，即得。

为了更好地对复方疮疡搽剂质量进行有效控制，本实验采用HPLC 法同时测定该制剂中盐酸小檗碱、绿原酸、没食子酸、阿魏酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素的含量的含量，以期确保该制剂临床应用的安全有效。

1 材料

1.1 仪器 Waters e2695 高效液相色谱仪，配置PDA 2998 二极管阵列检测器（美国Waters 公司）；RE-2000B 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；AY120 电子天平（十万分之一，日本岛津公司）。

1.2 试剂与药物 盐酸小檗碱（批号110713-200910，纯度 97.9%）、绿原酸（批 号 MUST-17030620，纯度99.39%）、没食子酸（批号MUST-16022801，纯度99.04%）、阿魏酸（批号MUST-17010908，纯度99.32%）、芦荟大黄素（批号MUST-16031605，纯度98.64%）、大黄酸（批号MUST-16031604，纯度98.68%）、大黄素（批号MUST-16031601，纯度98.40%）对照品均购自中国科学院成都生物研究所。复方疮疡搽剂（自制，批号20160823、20160825、20160827、20160829、20160831、20160902）。乙腈为色谱纯（德国默克公司）；其他试剂均为分析纯；水为屈臣氏纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 美国Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脱（0～5 min，5%～95%B；5～7 min，7%～93%B；7～15 min，11%～89%B；15～25 min，13%～87%B；25～40 min，18%～82%B；40～50 min，30%～70% B；50～100 min，85%～15%B）；体积流量0.8 mL／min；柱温25 ℃；检测波长315 nm（0～11.00 min）、320 nm（11.01～25.30 min）、358 nm（25.31～90.00 min）、440 nm（90.01～125.00 min）；进样量5 μL。

2.2 供试品溶液制备 取本品50 mL，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，50%甲醇制成分别含没食子酸1.54 mg／mL、绿原酸1.016 mg／mL、阿魏酸0.104 mg／mL、盐酸小檗碱0.120 mg／mL、芦荟大黄素0.008 mg／mL、大黄酸0.042 mg／mL、大黄素0.023 mg／mL 的贮备液，分别精密量取1 mL（绿原酸储备液2 mL），置于10 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，即得。

2.4 阴性样品溶液制备 按本品处方工艺，分别制备缺金银花，缺当归，缺乌梅，缺五倍子，缺诃子，缺大黄，缺黄柏，缺五倍子、诃子，缺金银花、乌梅，缺金银花、当归、乌梅阴性样品，按“2.2”项下方法制备，即得。

2.5 专属性考察 吸取供试品、对照品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品溶液中各成分色谱峰在对照品溶液相应位置上一致，阴性样品溶液对测定无影响，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6 线性关系考察 精密吸取“2.3”项下对照品溶液3、5、10、15、20、25 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液（批号20160823）5 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得各成分峰面积RSD 分别为没食子酸0.43%、绿原酸0.37%、阿魏酸1.92%、盐酸小檗碱0.75%、芦荟大黄素0.70%、大黄酸0.89%、大黄素0.85%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验 取同一批本品（批号20160823）适量，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，精密吸取5 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得各成分峰面积RSD 分别为没食子酸1.11%、绿原酸1.05%、阿魏酸1.91%、盐酸小檗碱1.12%、芦荟大黄素1.19%、大黄酸0.80%、大黄素1.43%，表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液（批号20160823）5 μL，于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得各成分峰面积RSD 分别为没食子酸0.61%、绿原酸0.63%、阿魏酸1.90%、盐酸小檗碱0.81%、芦荟大黄素1.00%、大黄酸0.66%、大黄素1.00%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验 精密吸取同一份供试品溶液（批号20160823）2、15 mL，平行6份，精密加入对照品没食子酸6.00 mg、绿原酸6.36 mg；精密称取阿魏酸6.40 mg、盐酸小檗碱6.55 mg、芦荟大黄素5.50 mg、大黄酸6.30 mg、大黄素9.00 mg，50% 甲醇溶解，制成质量浓度分别为0.006 4、0.013 1、0.001 1、0.006 3、0.001 8 mg／mL的溶液，分别精密吸取1 mL，再精密吸取同一份供试品溶液（批号20160823）1 mL，一同置于2 mL 量瓶中，50%甲醇定容，同法平行制备6份，分别精密吸取5 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，没食子酸平均加样回收率为99.36%，RSD 为0.03%；绿原酸平均加样回收率为96.34%，RSD 为0.09%；阿魏酸平均加样回收率为96.34%，RSD 为0.09%；盐酸小檗碱平均加样回收率为97.16%，RSD 为0.04%；芦荟大黄素平均加样回收率为100.96%，RSD 为1.56%；大黄酸平均加样回收率为97.62%，RSD 为0.67%；大黄素平均加样回收率为99.96%，RSD 为1.23%。

2.11 样品含量测定 取6 批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取5 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，每批平行5次，计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果（mg／mL， n＝5）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／mL， n＝5）

3 讨论

3.1 流动相选择 本实验考察不同流动相对各成分色谱峰分离的影响，发现加入一定量磷酸可优化峰形，改善分离效果，并随着其体积分数升高效果更明显，但酸度越高，对色谱柱的损伤也越大，而且色谱柱所承受的pH 范围也较窄。最终确定，流动相为乙腈-0.2%磷酸。

3.2 温度选择 本实验分别考察在20、25、30、35 ℃柱温下各成分色谱峰分离情况，发现随着柱温升高，色谱峰保留时间提前，在20 ℃下出峰少，峰矮小；25 ℃下峰型理想，分离度良好；30、35℃下出峰时间提前，但其分离度有所降低。最终确定，柱温为25 ℃。

3.3 检测波长选择 各成分极性跨度大，在单一波长下溶剂峰和杂质峰对其影响较大，故采用定时波长进行检测，分别设定为0～11.00 min，315 nm；11.01～25.30 min，320 nm；25.31～90.00 min，358 nm；90.01～125.00 min，440 nm。

3.4 指标成分选择 复方疮疡搽剂中金银花主要成分为绿原酸，当归主要成分为阿魏酸，大黄主要成分为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素，黄柏主要成分为盐酸小檗碱，乌梅、五倍子、诃子主要成分为没食子酸，故选择上述7 种成分作为指标。

4 结论

本实验建立HPLC 法同时测定复方疮疡搽剂中盐酸小檗碱、绿原酸、没食子酸、阿魏酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素的含量，该方法稳定可靠，可更好地对该制剂质量进行控制，并为相关新药开发提供参考。