湿疹康凝胶制备工艺优化及质量评价

雷雅婷 张也刘隆基黄丹罗堃严建业*李顺祥*

（1.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙410208； 2.湖南中医药大学科技创新中心，湖南 长沙410208）

湿疹，中医又称为“湿疮”［1］，大约有20%的儿童及10%的成人患有本病［2］，随着生活水平提高及生活方式、体质差异、环境改变，其发病率近年来有上升趋势［3］。目前，治疗湿疹，特别是婴幼儿湿疹尚无特效药，西医大多采用皮质类固醇、免疫抑制剂等［4］，虽能有效改善症状，但易复发，不良反应较多，而中药具有不良反应少可有效减少复发、价格低廉等优点。

湿疹康油剂是湖南中医药大学附属中西医结合医院用于治疗湿疹的临床验方，由蛋黄油、苦参生物碱提取物、冰片等组成，临床疗效肯定，而且无任何不良反应，但存在易弄脏衣物、使用不便、生物利用度低等缺点，前期课题组已将其制成凝胶剂，对改善其生物利用度和用药依从性、提高临床疗效具有重要意义。

本实验在单因素试验基础上，采用星点设计-效应面法［5］来优化湿疹康凝胶制备工艺，再通过HPLC 法对具有抗菌、抗炎、免疫调节等生物活性的苦参碱、氧化苦参碱进行含量测定［6］，以期为该制剂开发利用奠定基础，也为临床治疗婴幼儿湿疹、湿疹性皮炎提供安全高效的外用新型制剂。

1 材料

1.1 仪器 Waters e2695 色谱仪（美国Waters 公司）；KQ5200DV 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CP224C 分析天平（上海奥豪斯仪器有限公司）；数显电动搅拌器（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；WGL-230B 型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；PHS-3C 型PH 计（杭州齐威仪器有限公司）；NDJ-8s 数显黏度计（上海越平科学仪器有限公司）；ELGA 超纯水系统（英国ELGA Lab Water 公司）。

1.2 试剂与药物 3 批湿疹康凝胶剂（自制，批号20191103、20191104、20200706）。鲜鸡蛋（批号20191021、20200319，南县顶香蛋鸡养殖专业合作社）。苦参（批号20190807，众益堂中药材销售有限公司）、冰片（批号20181107，福建省青松股份有限公司）经湖南中医药大学中药鉴定教研室龚力民副教授鉴定，分别为豆科植物苦参Sophora flavescensAit.的干燥根、合成冰片。苦参碱（批号110805-201709，纯度≥98%）、氧化苦参碱（批号110780-201508，纯度≥98%）对照品均购于中国食品药品检定研究院。乙腈、无水乙醇为色谱纯，购于美国Merck 公司；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 凝胶剂制备 取鲜鸡蛋适量，煮熟取蛋黄，过24 目筛制粒，鼓风干燥直至无水分逸出，取适量至圆底烧瓶中，加8、6 倍量95%乙醇回流提取2次，时间分别为2、1.5 h，纱布过滤，合并2 次滤液，减压回收乙醇至无醇味，得到蛋黄油。

取苦参粗粉适量，加10、8 倍量60%乙醇超声提取2次，时间分别为1.5、1 h，棉花过滤，合并2 次滤液，滤液加1% HCl 调节pH 至3～4，抽滤，弃去沉淀；酸水液加10% NaOH 调节pH至10～11，抽滤，弃去沉淀；碱水液浓缩，置于烘箱中干燥，得浸膏，加水分散，弃去不溶物，三氯甲烷萃取3次，弃去水层，合并三氯甲烷层，回收三氯甲烷至干，于烘箱干燥，得到苦参生物碱提取物。

取适量甘油至干燥烧杯中，加入卡波姆940 搅拌均匀，再加入超纯水充分溶胀，作为基质Ⅰ，静置过夜；将冰片加到蛋黄油中，搅拌均匀，作为基质Ⅱ，将基质Ⅰ加到基质Ⅱ中，搅拌均匀，滴加聚山梨酯80，搅拌均匀，滴加丙二醇，搅拌均匀，加入溶有苦参生物碱提取物、山梨酸钾的超纯水，搅拌均匀，三乙醇胺调节pH 至6～7，一直搅拌直至呈乳胶状，即得。

2.2 评价指标确定

2.2.1 外观 凝胶外观应光滑，均匀细腻，无分层，无团块，无气泡，各项指标均理想者为5分，根据均匀度、有无分层、有无团块气泡及其大小给予不同分数。

2.2.2 理化性质

2.2.2.1 黏度 在室温（25 ℃）下测定黏度，选用3号转子，设定转速为1.5 r／min，黏度在40 000～50 000 mPa·s 范围内者为5分，根据其实际数值给予不同分数。

2.2.2.2 粘附力 按照NaKamura［7］报道的方法，将100 g 热琼脂（1%）或黏蛋白（2%）溶液（溶剂为pH ＝7.0 的磷酸盐缓冲液）均匀涂抹于20 cm×20 cm 的玻璃板上，在4～8 ℃下放置3 h，在温度22 ℃、相对湿度77%下平衡1 h，再将凝胶滴于玻璃板的一端并呈90°放置，测定在0.5、1、2、3、4、5 h 的移动距离，最小者为5分，根据其实际数值给予不同分数。

2.2.2.3 涂展性 凝胶应易涂于皮肤上，能快速铺展，无油腻感，较为舒适，各项指标均理想者为5分，根据铺展难易、速度、舒适感给予不同分数。

2.2.2.4 pH值在室温（25 ℃）下取凝胶2 g，加入20 mL水，正反方向搅拌5 min，测定pH值，在6～7 范围内者为5分，根据其实际数值给予不同分数。

2.2.2.5 保湿率 参考文献［8］报道，精密称取凝胶适量，干燥至恒定质量m0，均匀涂布于载玻片上，置于温度（25±1）℃、相对湿度（43.16±0.39）%的恒温恒湿密闭干燥器中24 h 后取出，精密称定质量mt，计算保湿率，公式为保湿率＝（mt／m0）×100%，最高值者为5分，根据其实际数值给予不同分数。

2.2.3 稳定性 参考文献［9］报道。

2.2.3.1 离心稳定性 取5 g 凝胶至5 mL 玻璃离心管中，3 000 r／min 离心15 min，有分层现象为0分；未分层者继续离心15 min，有分层现象为1分；未分层者继续离心15 min，不分层为5分，轻度分层为3分，明显分层为1 分。

2.2.3.2 耐热稳定性 取5 g 凝胶至5 mL 玻璃离心管中，50 ℃恒温箱内放置48 h，不分层为5分，轻度分层为3分，明显分层为1 分。

2.2.3.3 耐寒稳定性 取5 g 凝胶至5 mL 玻璃离心管中，-20 ℃冰箱中放置48 h，不分层为5分，轻度分层为3分，明显分层为1 分。

2.2.3.4 耐冷稳定性 取5 g 凝胶至5 mL 玻璃离心管中，4 ℃冰箱中放置48 h，不分层为5分，轻度分层为3分，明显分层为1 分。

2.2.4 综合评分计算 凝胶外观应光滑细腻，具有一定的黏度，能粘附在皮肤上，使有效成分更充分地发挥药效，在常温时保持胶状，不干涸或液化，并在运输贮存过程中要具有一定的稳定性。因此，对“2.2.2”“2.2.3”项下指标赋予权重，公式分别为理化性质＝（黏度评分＋粘附力评分＋涂展性评分＋pH 评分＋保湿率评分）× 20%、稳定性＝（离心稳定性评分＋耐热稳定性评分＋耐寒稳定性评分＋耐冷稳定性评分）× 25%，综合评分＝外观× 0.2 ＋理化性质× 0.5 ＋稳定性× 0.3。

2.3 单因素试验 按“2.1”项下方法，改变凝胶剂中某一种物料成分的用量，固定其他用量不变，制备凝胶剂［10］，以“2.2.4”项下综合评分为指标，对卡波姆940、蛋黄油、甘油、聚山梨酯80、丙二醇用量、pH 值进行考察，发现卡波姆940、蛋黄油、聚山梨酯80 用量对制备工艺的影响较大，三者范围分别为0.9%～1.1%、40%～60%、2%～5%。

2.4 星点设计-效应面法 在单因素试验基础上，选择卡波姆940 用量（X1）、蛋黄油用量（Χ2）、聚山梨酯80 用量（X3）作为影响因素，“2.2.4”项下综合评分（Y）作为评价指标，星点设计-效应面法［11］优化制备工艺，因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

通过Design-Expert 8.0.6 软件对表2 数据进行多元回归拟合，得到方程为Y＝4.82 ＋0.000X1-0.39X2＋ 0.19X3＋ 0.025X1X2-0.025X1X3＋0.050X2X3-0.，方差分析见表3。由此可知，模型F为109.75，P＜0.000 1，表明其影响极显著；失拟项P＝0.788 0＞0.05，表明模型无失拟现象，可用于预测。

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

采用Design-Expert 8.0.6 软件进行响应面分析［12］，结果见图1。由此可知，综合评分随着卡波姆、蛋黄油、聚山梨酯80 用量增加均呈先升后降的趋势，以蛋黄油、聚山梨酯80 用量更明显。最终确定，最优工艺卡波姆940 用量1.00%，蛋黄油用量47.59%，聚山梨酯80 用量4.13%。

图1 各因素响应面图Fig.1 Response surface plots for various factors

再按照上述优化工艺平行制备3 份凝胶，进行验证试验，结果见表4。由此可知，综合评分与预测值接近，偏差均小于2%，表明模型预测性良好，工艺稳定可行。

表4 验证试验结果（n＝3）Tab.4 Results of verification tests（n＝3）

2.5 质量评价

2.5.1 外观性状观察 根据2020 版《中国药典》四部制剂通则0114［13］，发现凝胶均匀细腻，在常温下保持凝胶状，不干涸或液化，黏度适中，易涂布于皮肤，不下沉、结块。

2.5.2 pH 值测定 取3 批凝胶至烧杯中，每批2 g，加20 mL 超纯水搅拌5 min，测定pH，每批3次，测得平均pH 值分别为6.47、6.52、6.50。

2.5.3 离心稳定性考察 取3 批凝胶至10 mL 离心管中，每批5 g，3 000 r／min 离心30 min 后取出，发现无分层、药物析出、出现沉淀等现象，表明制剂离心稳定性良好。

2.5.4 黏度测定 在室温（25 ℃）下测定3 批凝胶黏度，选用3 号转子，设定转速为1.5 r／min，测得黏度均在40 000～50 000 mPa·s 范围内。

2.6 苦参碱、氧化苦参碱含量测定

2.6.1 色谱条件 Hypersil HN2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-无水乙醇-3%磷酸，梯度洗脱，程序见表5；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长220 nm；进样量10 μL。

表5 梯度洗脱程序Tab.5 Gradient elution programs

2.6.2 对照品溶液制备 分别精密称取对照品苦参碱0.006 2 g、氧化苦参碱0.006 0 g，加入3 mL乙腈，制成两者质量浓度分别为2.07、2.00 mg／mL的贮备液，分别吸取36、113 μL，乙腈定容至3 mL，即得（苦参碱、氧化苦参碱质量浓度分别为25、75 μg／mL）。

2.6.3 供试品溶液制备 参考文献［14］报道，精密称取凝胶1.0 g，置于具塞三角锥形瓶中，加浓氨试液l mL、三氯甲烷20 mL，密塞，称定质量，超声提取40 min，放冷，三氯甲烷补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液至蒸发皿中，蒸干，残渣加无水乙醇超声溶解，转移至25 mL 量瓶中，无水乙醇定容至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.6.4 阴性样品溶液制备 精密称取缺苦参碱、氧化苦参碱的阴性样品1.0 g，按“2.6.3”项下方法制备，即得。

2.6.5 专属性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.6.1”项色谱条件下进样测定，结果见图2。由此可知，供试品溶液色谱图在对照品溶液相应位置有相同色谱峰，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图2 各成分HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents

2.6.6 方法学考察

2.6.6.1 线性关系考察 精密吸取不同质量浓度对照品溶液各10 μL，在“2.6.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）进行回归，得苦参碱、氧化苦参碱方程分别为Y＝5 247.4X-5 147.9（r＝1.000 0）、Y＝4 831.4X-13 230（r＝0.999 9），分别在2.5～50.0、7.5～150.0 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.6.6.2 精密度试验 精密称取凝胶适量，按“2.6.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.6.1”项色谱条件下进样测定6次，测得苦参碱、氧化苦参碱峰面积RSD 分别为0.56%、0.25%，表明仪器精密度良好。

2.6.6.3 重复性试验 精密称取同一批凝胶，按“2.6.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.6.1”项色谱条件下进样测定，测得苦参碱、氧化苦参碱含量RSD 分别为1.51%、1.91%，表明该方法重复性良好。

2.6.6.4 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.6.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得苦参碱、氧化苦参碱峰面积RSD 分别为1.16%、1.94%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.6.6.5 加样回收率试验 取各成分含量已知的凝胶6份，每份约0.5 g，精密称定，加入一定量对照品溶液，按“2.6.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.6.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，计算回收率。结果，苦参碱、氧化苦参碱平均加样回收率分别为96.66%、99.33%，RSD 分别为0.90%、2.13%。

2.6.7 样品含量测定 精密称取3 批凝胶，每批1.0 g，平行3份，按“2.6.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.6.1”项色谱条件下各进样测定10 μL，计算含量，结果见表6。

表6 各成分含量测定结果（mg／g）Tab.6 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 讨论

在给药系统制备工艺优化中，常需考察多个因素的多个水平，为减少试验次数，并考察不同因素之间的相互作用［15］，本实验在单因素试验基础上，采用星点设计-效应面法优化湿疹康凝胶制备工艺，发现卡波姆940、蛋黄油、聚山梨酯80 用量过少或过多都会影响黏度、涂展性、细腻度等。验证试验表明，按最优工艺制备的湿疹康凝胶剂综合评分高，而且与预测值接近，表明模型拟合度高，具有良好的预测能力，为该制剂开发提供了可靠的科学依据。

苦参碱、氧化苦参碱作为苦参主要有效成分，具有抗皮肤炎症和变态反应、防止皮肤疤痕形成等作用，临床上广泛用于湿疹治疗［16］。本实验采用HPLC 法同时对最优工艺所制得湿疹康凝胶中苦参碱、氧化苦参碱含量进行测定，发现该方法专属性强，准确可靠，简便快速，可用于该制剂质量控制，并为其质量标准的制定奠定了基础。