UPLC法同时测定风热感冒颗粒中13种成分

李婷婷，王 淼，王 欣，黄晓婧，孔卫东，曾 桢，刘 莉*

(1.成都市药品检验研究院，国家药品监督管理局中药材质量监测评价重点实验室，四川 成都 610045；2.成都市农业质量监测中心，四川 成都 610041)

风热感冒颗粒由板蓝根、连翘、薄荷、荆芥穗、桑叶、芦根、牛蒡子、菊花、苦杏仁、桑枝、六神曲11味药材制成，具有清温解毒、宜肺利咽之功效，常用于治疗风热感冒、鼻塞、头痛、咳嗽、多痰等症[1]，该制剂现行质量标准主要是《卫生部药品标准》中药成方制剂第一册，但仅有性状、制剂通则检查项，无含量测定项。现有文献[2-5]也主要集中于牛蒡子苷、连翘苷、苦杏仁苷、绿原酸等成分的含量测定，不能从整体上控制风热感冒颗粒内在质量。

现代药理研究表明，(R,S)-告依春、新绿原酸、绿原酸、苦杏仁苷、隐绿原酸、连翘酯苷I、连翘酯苷A、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、连翘苷、牛蒡苷、牛蒡苷元为风热感冒颗粒活性成分[6-14]。因此，本实验参考文献[15-18]，将建立UPLC法同时测定风热感冒颗粒中上述13种成分的含量，以期更全面、科学、快速地控制该制剂质量。

1 材料

1.1 仪器 Waters Acquity H Class超高效液相色谱仪(美国沃特世科技公司)；XPE26(0.001 mg)、ME204E电子天平(0.1 mg)(瑞士梅特勒-托利多公司)；SK250H超声仪(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物 (R,S)-告依春(批号111753-201706，纯度100.0%)、绿原酸(批号110753-201817，纯度96.8%)、苦杏仁苷(批号110820-201808，纯度88.2%)、连翘酯苷A(批号111810-201707，纯度97.2%)、连翘苷(批号110821-201816，纯度95.1%)、牛蒡苷(批号110819-201812，纯度95.0%)对照品均由中国食品药品检定研究院提供；新绿原酸(批号19042305，纯度≥98%)对照品由成都普菲德生物技术有限公司提供；隐绿原酸(批号MUST-20042403，纯度99.07%)、连翘酯苷I(批号MUST-20041612，纯度98.26%)、异绿原酸B(批号MUST-20031602，纯度99.05%)、异绿原酸C(批号MUST-20031603，纯度99.84%)、牛蒡苷元(批号MUST-19060509，纯度99.62%)对照品均由成都曼斯特生物科技有限公司提供；异绿原酸A(批号ST03860120，纯度≥98.0%)对照品由上海诗丹德标准技术服务有限公司提供。风热感冒颗粒共12批(A企业，批号S1；B企业，批号S2、S3；C企业，批号S4、S5；D企业，批号S6；E企业，批号S7；F企业，批号S8；G企业，批号S9；H企业，批号S10、S11；I企业，批号S12)。甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Acquity UPLC Hss T3色谱柱(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流动相乙腈(A)-0.01%磷酸(B)，梯度洗脱(0～5 min，5%A；5～10 min，5%～11%A；10～11 min，11%～12.5%A；11～20 min，12.5%～19%A；20～30 min，19%～28%A；30～35 min，28%～31%A；35～40 min，31%～40%A；40～45 min，40%A)；体积流量0.5 mL/min；柱温30 ℃；检测波长0～4 min 240 nm，4～9.2 min 327 nm，9.2～11.5 min 207 nm，11.5～26 min 327 nm，26～45 min 227 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，甲醇溶解，摇匀，滤过，即得[各成分质量浓度分别为(R,S)-告依春541.00 μg/mL、新绿原酸502.94 μg/mL、绿原酸630.17 μg/mL、苦杏仁苷452.02 μg/mL、隐绿原酸571.34 μg/mL、连翘酯苷I 548.68 μg/mL、连翘酯苷A 719.09 μg/mL、异绿原酸B 520.61 μg/mL、异绿原酸A 618.38 μg/mL、异绿原酸C 504.79 μg/mL、连翘苷505.84 μg/mL、牛蒡苷1 040.44 μg/mL、牛蒡苷元626.51 μg/mL]。

2.2.2 供试品溶液 精密称取本品5.0 g，置于锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，称定质量，超声提取30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方比例，制备缺板蓝根、菊花、苦杏仁、连翘、牛蒡子、桑叶、桑枝的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 系统适应性考察 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下各进样1 μL 测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰峰形良好，阴性无干扰。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密量取对照品溶液适量，甲醇稀释成系列质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.4.2 精密度试验 精密吸取同一份对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得(R,S)-告依春、新绿原酸、绿原酸、苦杏仁苷、隐绿原酸、连翘酯苷I、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、连翘苷、牛蒡苷、牛蒡苷元峰面积RSD分别为1.38%、1.42%、1.41%、1.31%、1.37%、1.47%、1.47%、1.29%、1.48%、1.48%、1.40%、1.41%、1.47%，表明仪器精密度良好。

1.(R，S)-告依春 2.新绿原酸 3.绿原酸 4.苦杏仁苷 5.隐绿原酸 6.连翘酯苷I 7.连翘酯苷A 8.异绿原酸B 9.异绿原酸A 10.异绿原酸C 11.连翘苷 12.牛蒡苷 13.牛蒡苷元1.(R,S)-epigoitrin 2.neochlorogenic acid 3.chlorogenic acid 4.amygdalin 5.cryptochlorogenic acid 6.forsythoside I 7.forsythoside A 8.isochlorogenic acid A 9.isochlorogenic acid B 10.isochlorogenic acid C 11.forsythin 12.arctiin 13.arctigen图1 各成分UPLC色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.4.3 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，于0、4、8、12、16、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得(R,S)-告依春、新绿原酸、绿原酸、苦杏仁苷、隐绿原酸、连翘酯苷I、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、连翘苷、牛蒡苷、牛蒡苷元峰面积RSD分别为2.58%、2.19%、2.18%、2.08%、1.31%、1.38%、1.95%、1.76%、1.69%、1.86%、2.02%、2.25%、2.42%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取同一批样品，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得(R,S)-告依春、新绿原酸、绿原酸、苦杏仁苷、隐绿原酸、连翘酯苷I、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、连翘苷、牛蒡苷、牛蒡苷元含量RSD分别为2.05%、1.62%、2.28%、2.72%、1.85%、2.75%、1.10%、1.98%、1.84%、1.79%、1.51%、1.85%、1.72%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的本品(批号20190101)粉末约2.5 g，共9份，每3份为1组，分别按50%、100%、150%水平精密加入对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，(R,S)-告依春、新绿原酸、绿原酸、苦杏仁苷、隐绿原酸、连翘酯苷I、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、连翘苷、牛蒡苷、牛蒡苷元平均加样回收率分别为96.14%、99.11%、99.46%，103.52%、99.87%、100.73%、100.33%、97.65%、97.89%、98.69%、95.42%、101.19%、100.25%，RSD分别为2.29%、1.41%、2.89%、2.33%、1.50%、2.25%、1.59%、1.98%、2.05%、2.01%、2.89%、2.39%、2.75%。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 样品含量测定 取12批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量(其中样品S10、S11中牛蒡苷含量超出标准曲线范围，故再分别精密量取1 mL至10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，重新进行计算)，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果(mg/g，n=3)Tab.2 Results of content determination of various constituents (mg/g，n=3)

3 讨论

3.1 提取方法筛选 本实验考察了不同提取方式(回流、超声)、提取溶剂、提取溶剂体积、提取时间对各成分提取率的影响，最终确定为25 mL甲醇超声提取30 min。

3.2 流动相系统筛选 由于风热感冒颗粒药味较多，各成分化学性质相差较大，故采用梯度洗脱。再考察了乙腈-磷酸、甲醇-磷酸流动相(磷酸体积分数为0.01%、0.02%、0.03%)，发现乙腈-0.01%磷酸洗脱时各成分色谱峰峰形对称，分离较好。

3.3 检测波长筛选 由于各成分紫外光谱差异较大，不能在同一波长下测定，为了兼顾其最大吸收波长，提高灵敏度，减少干扰，选择240、327、207、227 nm波长切换模式。

3.4 含量分析 表2显示，不同批次风热感冒颗粒中各成分含量存在较大差异，以(R,S)-告依春、连翘酯苷A、牛蒡苷更明显，可能与原药材产地、采收季节、企业生产工艺等因素有关。

4 结论

本实验建立UPLC法同时测定风热感冒颗粒中(R,S)-告依春、新绿原酸、绿原酸、苦杏仁苷、隐绿原酸、连翘酯苷I、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、连翘苷、牛蒡苷、牛蒡苷元的含量，该方法简便、快速、准确，可为更全面科学地评价和控制该制剂质量提供依据。