清胰Ⅱ号颗粒对急性胰腺炎小鼠的作用及其机制

2022-07-22杨晓燕杜艺玫张倩茹何芋岐郑传痴周旭美

中成药 2022年3期

杨晓燕，雷蕾，杜艺玫,4，秦琳,4，张倩茹,4，何芋岐，郑传痴，周旭美

(1.遵义医科大学药学院，贵州遵义 563003；2.遵义医科大学附属医院，贵州遵义 563003；3.遵义医科大学药学院药学实验室，贵州遵义 563003；4.遵义医科大学教育部药理重点实验室，贵州遵义 563003；5.遵义医科大学第二附属医院药剂科，贵州遵义 563003)

清胰Ⅱ号颗粒临床上用于治疗急性胰腺炎或重症急性胰腺炎。该方以大黄为君药，配伍栀子、延胡索、木香、赤芍等药材，具有利胆退黄、清热解毒、活血化瘀等功效[1-2]。清胰Ⅱ号颗粒在保护胰腺细胞、保护肠黏膜、调节炎性因子等方面具有显著活性[3-4]。为方便给药并提高患者依从性，清胰Ⅱ号颗粒已被开发成为复方颗粒制剂。

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一种由多病因诱导的胰腺局部及全身炎症性疾病，病死率较高、并发症较多，是消化系统危急重症之一[5]。AP发病机制较为复杂，主要有胰酶自身消化、炎性因子、胆源性胰腺炎等[6]，但机制尚不明确。胆汁淤积倒流引起的胰蛋白酶对胰腺组织的自身消化与AP发病直接相关[7-8]。胆汁酸是胆汁的重要组分，在AP发病过程中起到重要作用。法尼醇受体(Farnesoid X receptor,FXR)是胆汁酸代谢通路的关键酶，可调节胆汁酸代谢通路上OATP、OSTα/β、NTCP等代谢酶的表达进而控制胆固醇代谢成为胆汁酸[9-10]，维持胆汁酸稳态。研究表明，清胰Ⅱ号颗粒对急性胰腺炎的治疗作用与调节胆汁酸代谢、调节胆汁酸平衡有关。研究清胰Ⅱ号颗粒对FXR介导的胆汁酸代谢通路的影响，分析关键的调控靶点。

1 材料

1.1 动物雌性KM昆明种小鼠，体质量(20±2) g，由第三军医大学大坪医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK渝2012-0005，实验前适应性喂养1周。

1.2 试剂与药物大黄(批号150323)、栀子(批号150327)、延胡索(批号150323)、木香(批号150323)、赤芍(批号150327)、牡丹皮(批号150323)、厚朴(批号150323)、芒硝(批号150203)由遵义医科大学附属医院中药房提供，经遵义医科大学附属医院杨建文教授鉴定为正品。清胰Ⅱ号颗粒根据文献[11]报道的工艺制备。胆碱乙硫氨酸饲料(江苏协同饲料有限公司)。醋酸奥曲肽注射液(北京诺华制药有限公司)。引物(上海捷瑞生物工程有限公司)；Trizol(北京索莱宝科技有限公司)；SYBR green(美国Bio-Rad公司)。

1.3 仪器 AU5800全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特公司)；Thermo微量分光光度计(美国Thermo公司)；逆转录仪、实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 模型建立 40只小鼠分为4批，每批10只，分别给予无胆碱乙硫氨酸(CDE)饲料1、2、3、4 d，眼眶取血，3 000 r/min离心10 min，取血清，检测血清淀粉酶水平，根据其变化及小鼠死亡率来对造模时间进行筛选。

2.2 分组与给药 105只小鼠随机分为正常组，模型组，清胰Ⅱ号颗粒低、中、高剂量组，阳性对照组，阴性对照组，每组15只，除正常组外，其余各组小鼠按“2.1”项下方法造模，然后模型组立即处死。清胰Ⅱ号颗粒低、中、高剂量组，阳性对照组，阴性对照组立即停止饲喂CDE饲料，改为普通饲料。根据临床治疗时间，清胰Ⅱ号颗粒低、中、高剂量组分别按3.9、7.8、15.6 g/kg剂量给药3 d，阳性对照组给予醋酸奥曲肽(20 μg/kg)3 d，正常组、阴性对照组给予等体积生理盐水3 d，并且阴性对照组不给予药物治疗，用于观察急性胰腺炎发展。给药3 d后，检测小鼠血清淀粉酶水平，10%甲醛固定胰腺，HE染色观察其病理变化，肝脏在-80 ℃下冷冻保存。

2.3 qRT-PCR检测胆汁酸通路关键蛋白编码基因mRNA表达取小鼠肝脏组织10～30 mg，Trizol法提取总RNA，取2 μL，采用超微量分光光度计测定OD260/OD280值及RNA浓度，逆转录为cDNA。以Gapdh为内参，反应条件为95 ℃ 预变性30 s，95 ℃复性10 s，60 ℃退火45 s，循环39次，55 ℃延伸5 s，读取样本Ct值，计算基因相对表达。

3 结果

3.1 造模时间图1显示，给予CDE饲料后，模型组小鼠血清淀粉酶水平持续升高，3 d后更明显(P<0.05，P<0.05)，表明造模成功，但继续饲喂会导致小鼠大量死亡，故确定造模时间为3 d。

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01。图1 造模时间对小鼠血清淀粉酶水平的影响

3.2 清胰Ⅱ号颗粒对小鼠血清淀粉酶水平的影响图2显示，与模型组、阴性对照组比较，清胰Ⅱ号颗粒高、中、低剂量组小鼠血清淀粉酶水平降低(P<0.05)，但无明显量效关系。

注：与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，$P<0.05。图2 清胰Ⅱ号颗粒对小鼠血清淀粉酶水平的影响

注：A为正常组，B为模型组，C为清胰Ⅱ号颗粒低剂量组(3.9 g/kg)，D为清胰Ⅱ号颗粒中剂量组(7.8 g/kg)，E为清胰Ⅱ号颗粒高剂量组(15.6 g/kg)，F为阳性对照组，G为阴性对照组。图3 各组小鼠胰腺组织病理变化

3.3 小鼠胰腺组织病理变化图3显示，正常组小鼠未见胰腺肿大、变硬、充血、炎细胞浸润等胰腺炎症状；模型组小鼠胰腺组织出现大片凝固性坏死、细胞结构不清、出血及炎细胞浸润；清胰Ⅱ号颗粒低、中剂量组小鼠可见少量炎细胞浸润和肉芽组织增生，而高剂量组小鼠胰腺组织水肿减轻，出血明显改善，炎细胞浸润不显著；阳性对照组小鼠炎症、出血等症状得以改善；阴性对照组小鼠可见明显出血、炎细胞浸润，细胞轮廓不清晰等病理变化。

3.4 聚类分析采用RT-PCR测定胆汁酸通路上46个关键蛋白编码基因mRNA表达，并对其进行聚类分析，结果见图4，可知清胰Ⅱ号颗粒高剂量组与正常组聚为一类，清胰Ⅱ号颗粒中、低剂量组聚为一类并与清胰Ⅱ号颗粒高剂量组、正常组共聚为一类，阴性对照组与模型组聚为一类。由此表明，小鼠给予高剂量清胰Ⅱ号颗粒后，其胆汁酸通路的整体基因轮廓可回调至近正常状态，而中、低剂量组作用不显著；与模型组比较，阴性对照组小鼠胆汁酸通路基因轮廓未明显改善。

3.5 主成分分析图5A显示，阴性对照组与正常组在图上分布于不同的象限，表明急性胰腺炎小鼠在胆汁酸代谢通路的基因调控上有显著变化；不同剂量清胰Ⅱ号颗粒干预后，对上述变化均表现出一定回调，并且与正常组在得分图上重合。图5B显示，Mapk1对组间区分贡献最大，即为受清胰Ⅱ号颗粒复方颗粒影响最明显的基因。另外，虽然Slco1a1在聚类分析中表现出较大变化，但主成分分析表明它对组间区分的贡献明显弱于Mapk1。

注：白色表示上调，灰色表示下调，黑色代表无明显变化。图4 清胰Ⅱ号颗粒对小鼠胆汁酸通路基因表达调控的聚类分析图

图5 清胰Ⅱ号颗粒对小鼠胆汁酸通路基因表达调控的主成分分析图

图6 清胰Ⅱ号颗粒对Mapk1、Slcola1基因表达的调控作用

3.6 基因表达分析图6显示，Mapk1、Slco1a1基因表达调控与清胰Ⅱ号颗粒疗效呈正相关，前者在模型组中显著上调，在阴性对照组中无回调，而在清胰Ⅱ号颗粒高、中、低剂量组中显著下调；后者在模型组、阴性对照组中显著上调，在清胰Ⅱ号颗粒高剂量组中显著下调。由此表明，Mapk1、Slco1a1可能是胰腺炎发病及治疗的关键靶点基因。

4 讨论

本实验采用CDE饲料诱导小鼠急性胰腺炎，给予不同剂量的清胰Ⅱ号颗粒，通过测定血清淀粉酶并结合病理观察。结果发现，清胰Ⅱ号颗粒可显著改善胰腺病理情况、降低血清淀粉酶、改善胰腺出血、减少单核细胞等炎性细胞渗出。

胰腺炎患者胰腺组织广泛坏死后，其血清淀粉酶水平可能与正常水平持平甚至更低，检测结果易受其他因素影响而出现误差[12]。当急性胰腺炎发病后，血清淀粉酶可上升，但在3 d后血清淀粉酶的水平也会逐渐降低[13]，本实验表现出相应的趋势，阴性对照组的AMS低于正常组。因此，为避免实验误差，采用AMS、病理切片对清胰Ⅱ号颗粒的药理作用进行综合评价。

胆汁的分泌、吸收、代谢受到疾病因素、不良饮食习惯等影响[14]，胆道中的胆汁酸和胆固醇严重失衡，造成胆固醇在胆管沉积形成结石[15]而滞留于胆道系统。持续的胆结石累积或胆结石摩擦导致胰胆管共同解剖通路堵塞，胆汁及胰液流入十二指肠的过程受阻[7]。胆汁酸等消化液返流回胰腺，激活的胰酶原对胰腺自身组织结构进行消化，从而导致胰腺炎的发生[8]。清胰Ⅱ号颗粒给药之后，小鼠胆汁酸通路的Mapk1和Slco1a1显著下调。

Mapk1是一组能被内源性物质激活的蛋白激酶，是细胞内重要的信号传导系统。在胆汁酸代谢通路(图7)中，Mapk1信号通路是通过肠道调节肝脏胆汁酸合成与转运的重要途径，在胰腺炎中起到重要的作用[16]。肝脏合成的胆汁酸会通过转运蛋白转运至胆管，通过胆管进入小肠，在小肠内激活肠道FXR，肠道FXR上调肠上皮成纤维细胞因子(Fibroblast growth factors,FGF15)的表达[17]，而后者会随着门静脉血流进入肝脏并转运至肝细胞内诱导Mapk1表达进而抑制Cyp7a1和Cyp8b1的表达[18]，抑制胆固醇代谢为胆汁酸。Slco1a1是动物及人体内重要的膜转运蛋白，介导了胆汁酸的细胞转运[19]，胆汁酸是OATP1的配体，FXR可以抑制OATP1表达减少胆汁酸的吸收[20]。