基于“双抗体夹心法”全自动酶免工作站检测方法的建立

李玉立,邵天舒,赵璇,李潇,何欢,梅婕,李文东（北京市药品检验研究院 国家药品监督管理局创新药物安全研究与评价重点实验室 中药成分分析与生物评价北京市重点实验室,北京 102206）

酶联免疫吸附试验（ELISA）最早由瑞典斯德哥尔摩大学的Engvall和Perlmann于1971年建立[1]。Engvall等4位研究者基于一种非放射性标记的免疫分析技术，建立了酶联免疫分析方法[2]。他们将抗原或抗体与酶偶联，通过免疫荧光检测，于1970年获得第一个ELISA校准曲线[3]。早期的ELISA由于特异性不高而妨碍了其在实际中应用的步伐，随着单克隆抗体技术发展，用于测量抗原的“夹心”ELISA试验被开发出来，该方法快速、简单且具有很好的灵敏度[4]。加之多功能酶标仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，如今ELISA方法已涉及多种细菌和病毒的检测，被用于疾病的诊断（如HIV检测[5]）、动物检疫、疫苗效力检测等方面，成为应用最广泛的检测方法之一。

随着自动化检测技术的发展，全自动酶免工作站开始被熟知和使用，我国引入自动化酶免工作站的历史可以追溯到上世纪90年代末期[6]。本文所使用工作站为瑞士帝肯（Tecan）制造，该公司全自动酶免工作站自20世纪初被引入[7-9]，至今用途广泛，涉及兽医卫生领域[10]、临床疾病筛查[11]、血液样本分析[12]等。该工作站目前在国内用户较多，在多领域进行广泛使用[13-15]，它可以根据用户的实验需求进行配置，同时满足高通量和灵活性的要求。

本文所采用“双抗体夹心法”是酶联免疫吸附试验（ELISA）的一种，是指将能够与抗原特异性结合的抗体与固相载体结合后，再与抗原反应，然后与辣根过氧化物酶HRP标记物结合，形成夹心。最后加入TMB底物显色，颜色的深浅和样品中的待测抗原呈正相关。双抗体夹心法测定抗原含量，特别是当抗原含量较低需要二次放大信号的情况下，操作步骤多、过程繁琐、耗时较长。本文中所测定的抗原样本就是此类情况。一般情况下，技术熟练的实验员每天可完成1-2块酶标板，即10-20批次的实验任务，耗时较长，效率较低。本文以全自动酶免工作站为依托设计了全自动化的检测方法，实现了除解吸附步骤以外的实验全过程的自动化操作。在此基础上，通过人机比对实验确认了全自动方法的可行性，并考察了诸多影响因素，最终建立了一种准确、高效，精密度良好的全自动检测方法以替代手工操作，极大地提高了实验效率，避免了手工操作的人员差异，更好地实现了双抗体夹心法的标准化操作。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 抗原样本：灭活疫苗。

1.1.2 标准品及主要试剂 全灭活疫苗抗原含量检测试剂盒（ELISA）（疫苗生产企业提供），具体包括96孔酶联反应板、检测抗体工作液、酶标抗体工作液、20倍洗涤液、显色液A、显色液B、终止液、解吸附剂、参考品。

1.1.3 仪器设备 Freedom EVO-2 150全自动酶免工作站（包括操作平台，Hydrospeed洗板机和Sunrise酶标仪）（瑞士Tecan公司）；50TS8洗板机（美国BioTek公司）；Varioskan™ LUX酶标仪（美国ThermoFisher公司）。

1.1.4 Freedom EVO-2 150全自动酶免工作站主要参数和布局图主机平台详见图1。

图1 Freedom EVO-2 150全自动酶免工作站台面布局图。注：工作站台面包括3×3个枪头位；4个储板位；2×6个孵育位；6个试剂位；3个加样板位；洗板模块；读数模块；2组微孔板堆栈

1.2 方法

1.2.1 试剂和样本准备 实验开始前，所有灭活疫苗样本恢复至室温，取样前轻柔震荡予以混匀。准备好试剂盒，取出参考品恢复至室温，并将浓缩洗板液用纯水进行20倍稀释，配置成工作浓度的洗板液。

1.2.2 待测样本的解吸附及稀释 取参考品和抗原样品各400μl，分别与400μl生理盐水混合，加入800μl的解吸附剂混匀，放置在室温25℃条件下反应1小时，其间每隔20分钟轻柔震荡混匀。

将解吸附后的参考品及样品用生理盐水再进行1倍、2倍、4倍、8倍稀释。稀释步骤分别由全自动酶免工作站完成和实验员手工操作完成。

1.2.3 双抗体夹心法手工操作规程 将稀释后的4个浓度梯度的参考品与样品分别加入酶标板中，每孔100μl，平行2孔，阴性对照（生理盐水）平行8孔，轻柔震荡混匀后，将酶标板用封板膜封好后放入洁净密封袋中，置于37℃恒温水浴箱中孵育120分钟。

在中职教育以及旅游业快速发展的过程中，中职旅游专业教育也进一步扩张。当前，中职旅游管理专业已经慢慢发展成为较为成熟的发展体系，不过在教学过程中并没有彻底摆脱传统的灌输式教学模式，这样就导致培养的人才不能满足社会发展需要。因此，旅游业重点关注的问题是各院校如何培养适应社会需要的旅游管理专业人才。通过实践调查研究发现，我国当前在旅游管理专业人才培养以及教育改革方面的研究比较少，特别是在“互联网+”时代，更应该加强此方面的探索。

取出酶标板，用洗板机清洗5次后拍干。用多道移液器将检测抗体工作液加入酶标板中，每孔100μl，37℃恒温水浴箱中孵育30分钟。再次取出酶标板，清洗5次后拍干，加入酶标抗体工作液，每孔100μl，37℃恒温水浴箱中孵育30分钟。取出酶标板，清洗5次后拍干，加入显色A液，每孔50μl，再加入显色B液，每孔50μl，轻柔震荡混匀后，37℃恒温水浴箱中孵育15分钟。

取出酶标板，用多道移液器将终止液加入酶标板中，每孔50μl。酶标仪于450/630nm双波长下读数，测定每孔OD值。

1.2.4 双抗体夹心法全自动酶免工作站操作规程 全自动酶免工作站操作规程的建立首先是对工作站主机平台布局的设计，在有限的空间内，需要实现多个步骤多种试剂多份耗材及多块酶标板的协同处理。该过程需要考虑诸多因素，如机械臂和加样通道的资源利用率，枪头位点的利用率及废弃枪头的处理等，因此，经过2个多月的数轮调试及硬件升级，最终实现了硬件完备，布局完善，流程设计高效。

首先，按照试剂盒操作规程结合工作站硬件结构进行编程，具体涉及步骤包括：四级稀释、孵育、洗板、加液、读数。各步骤之间的移板操作主要由机械臂（ROMA）完成，加液由96通道机械臂完成。其中四级稀释的编程较为复杂，除考虑两组样品的平行外，还需在尽量短的时间内完成稀释及上样操作。针对于多板测试的情况下，各板“四级稀释”需依次顺序进行，所以还需考虑期间的延时等待及后续步骤之间资源占用冲突等问题，最后，经过数十次的调试及测试，实现了六块酶标板（60批样品）同时进行“双抗体夹心法”测定体外效力。具体实验步骤流程详见图2。

图2 A：单板实验进程图（色带说明详见备注），B：六板实验进程图（色带说明详见备注）

全自动操作实验过程中，实验员按照提示运行相应程序直至检测完成即可。

1.2.5 数据处理 采用Statistic Analysis统计软件分析参考品与样品结果，选择连续3-4个稀释倍数的对数作为横坐标，OD值平均值的对数作为纵坐标，进行线性分析。计算样品体外相对效力。

2 验证实验和结果

2.1.1“双抗体夹心法测定样品体外相对效力”人机比对单板实验 按照上述方法，实验员和TECAN全自动酶免工作站分别对相同批号的5批次疫苗样本进行“双抗体夹心法”测定体外相对效力实验，对两种实验方式检测结果进行了比对分析，以确认TECAN全自动酶免工作站可替代手工操作进行“双抗体夹心法”的体外相对效力实验并给出可信结果，两份实验数据相对偏差应不大于15%[16]。

2.1.2 “双抗体夹心法测定样品体外相对效力”人机比对多板实验 同时测试多块酶标板的情况下，全自动酶免工作站需依次按顺序对每一块酶标板进行稀释，这一过程会导致最后一块酶标板的解吸附时间较第一块酶标板有所延长，为排除这段时间差可能导致的结果误差，设计了多板实验的比对。在全自动酶免工作站同时进行六块酶标板实验的同时，实验员手工进行第六块酶标板的平行实验，比对结果偏差。

2.1.3 “双抗体夹心法测定样品体外相对效力”避光情况考察显色液AB液为辣根过氧化物酶HRP的反应底物，暴露在光源下会发生变色，手工操作时需避光实验，即时加样；如进行全自动操作程序设计，实现即时加样需要中断程序，手工操作。为了全面实现自动化操作，考察了提前放置显色液AB情况下光照导致的变色是否对实验结果造成影响。分别设计“即时加样”和“提前放置”两种加显色液的方式，以确认实验结果是否存在偏差。

2.1.4 “双抗体夹心法测定样品体外相对效力”回收试剂考察酶联免疫法实验中使用的试剂一般有关键试剂和非关键试剂[16]，本试验中所考察的回收试剂属于关键试剂，包括抗体溶液、显色液等，其成分或稳定性有细小变化即会影响实验结果。同时抗体制备困难，供应紧张且成本较高，采用全自动酶免工作站实验各类试剂均不可避免地存在检测死体积，通过优化试剂盒的尺寸，已将死体积从30ml调整为10ml，为了进一步降低实验成本，节约试剂，考察了回收试剂进行二次使用对结果的影响。

2.1.5 全自动酶免工作站仪器精密度和方法精密度考察 采用全自动酶免工作站六板程序对9批样品进行了平行6次测定，分别对6次测定检测结果的原倍浓度的OD值和检测所得体外相对效力进行了比对，以确认工作站的操作精密度和方法精密度。

2.2 结果

2.2.1 “双抗体夹心法测定样品体外相对效力”人机比对单板实验结果详见表1，从表1可以看出5批样品的人机比对结果的相对偏差均小于15%，符合要求。

表1 人机比对单板实验结果

2.2.2 “双抗体夹心法测定样品体外相对效力”人机比对多板实验详见表2，从表2可以看出5批样品设置到全自动酶免工作站第六块板进行检测与手工操作检测结果的相对偏差均小于15%，符合要求。

表2 人机比对多板实验结果

2.2.3 “双抗体夹心法测定样品体外相对效力”避光情况考察结果详见表3，从表3可以看出，5批样品在显色液A和显色液B的即时加样和提前放置的检测结果的相对偏差均小于15%，符合要求，表明采用全自动酶免工作站进行60批样品检测时，可以提前放置显色液，不需中断程序，进行即时加样，更好地实现了全自动化操作。

表3 A/B液变色影响考察结果

2.2.4 “双抗体夹心法测定样品体外相对效力”回收试剂考察结果详见表4，从表4可以看出5批样品采用新鲜试剂和回收试剂的检测结果相对偏差均小15%，符合要求，表明使用回收试剂进行样品检测对结果的影响符合规定。采用回收试剂进行检验可以降低检验成本，节约检验资源，对于后续大批量检验具有重要意义。同时对回收试剂的存放期限进行了进一步的考察，结果表明首次试剂回收后于4℃冰箱保存1周，进行第二次实验，对实验结果基本无影响。后续笔者又进行了试剂第二次回收的考察，数据显示1个月内，多次重复回收的试剂均可正常使用。

表4 回收试剂考察结果

2.2.5 全自动酶免工作站仪器精密度和方法精密度考察结果详见表5和表6，从表5可以看出，9批样品采用六板程序平行检测6次的原倍浓度的检测OD值的变异系数符合《中国药典》2020年版四部《9012生物样品定量分析方法验证指导原则》[16]中批内变异系数不超过15%的要求，该结果表明全自动酶免工作站在样品的稀释操作，加样操作，洗板操作及酶标仪检测的精密度均符合要求。

表5 仪器操作精密度考察结果

表6 自动化方法精密度考察结果

表6为9批样品平行检测6次的体外相对效力结果，该结果的变异系数也符合以上指导原则的要求，该结果表明采用全自动酶免工作站进行体外相对效力检测的方法精密度符合规定，可以很好地替代手工操作，减少人工操作的偏差。

3 讨论

3.1 双抗体夹心法为半定量的检测方法，操作步骤多，不同人员操作对结果影响因素较大，通过采用多类型实验验证，采用全自动酶免工作站和手工操作检测结果偏差符合要求，结果平行性良好，可替代手工操作。

3.2 六板结果比对表明，第六块酶标板的四级稀释较第一块有50分钟左右的延迟，但对检测结果基本无影响。

3.3 回收试剂考察结果表明，提前放置显色液A/B变色后，不影响效力检测结果。后续按照提前放置显色液A/B的方法进行了近百批样品的检测，结果均正常。

3.4 精密度考察结果表明采用全自动酶免工作站在大批量样品检测中具有平行性良好、结果准确度高的优势。

3.5 为了后续扩展将解吸附操作实现自动化，本文对室温下疫苗的稳定性进行了初步考察，结果表明在室温24小时内，疫苗的体外相对效力结果稳定，为后续大批量样品的解吸附自动化操作提供了数据支撑。

当前新冠疫情仍在全球肆虐，变异毒株的不断出现更加大了防疫防控的难度，疫苗作为有效遏制疫情蔓延的最有利的武器，国内及国际的需求量急剧增加。为了全力配合疫情防控的要求，国内疫苗生产企业均进行了全面的扩产，必然导致原液、半成品和成品的效力检验任务的大幅度增加，对生产企业和批签发机构均提出了巨大的挑战。酶联免疫法作为当前测定疫苗效力指标的主要方法，开发全自动酶免工作站替代手工操作具有重要的意义，实现了多个步骤的标准化操作，减少了人工操作的偏差，对于提升检验效率、保障疫苗供应具有积极的作用，希望以上研究内容为开发全自动酶免工作站进行多种疫苗的效力检测提供有效的借鉴作用。