基于网络药理学探讨人参皂苷Rg1对慢性粒细胞白血病的作用机制

周雯，周玥，李渊，韩艳军，刘小虎

（云南大理大学组织学与胚胎学教研室，云南大理 671000）

慢性髓系白血病（Chronic myeloid leukemia，CML）是一种多能造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）的克隆性骨髓增生性疾病。CML的特征是存在BCR-ABL1融合基因，该基因编码一个组成型活性酪氨酸激酶，能够启动和维持疾病的致病驱动因子。致使大量下游信号通路激活，从而促进了遗传不稳定的髓样细胞的不受控制地扩增[1]，最终危及生命。目前主要采用伊马替尼等酪氨酸激酶活性抑制剂（TKIs）靶向治疗，尽管效果显著，但部分患者原发性或继发性耐药、长期器官毒性等不良反应的出现限制了TKIs的临床应用[2]。

中药在传统医学中由于安全、毒副作用小，对肝肾刺激性较弱占据了重要的地位，在多部位、多靶点疾病的总体调控方面具有突出的优势。人参皂苷Rg1是三七和人参的主要活性成分，具有多种生物学效应[3]。人参皂苷Rg1可改善肠道炎症、血管生成和放射诱导的肠损伤[4]。Rg1可通过激活SIRT1/TSC2信号通路抑制急性髓样白血病的细胞增殖并诱导其衰老[5]。此外，还有抗肝纤维化、抗肿瘤、延缓衰老、改善心血管系统代谢等功能[6]。Rg1的抗肿瘤也多有报道，但涉及CML的较少，其作用机制并不清楚，本文通过网络药理学研究Rg1作用于K562的靶点，为临床研究提供新的思路。

一、研究方法

（一）人参皂苷Rg1作用靶点的预测

使用PubChem数据库检索“ginsenoside Rg1”，并保存其sdf格式文件。将Rg1的sdf格式文件导入PharmMapper平台[7]。设置最大生成构象为300，人类蛋白作为药效基团，预测人参皂苷Rg1的潜在靶点，利 用Uniprot数 据 库 (https：//www.uniprot.org/)的Retrieve/ID mapping 功能将靶点蛋白名称转换为标准基因名称。删除重复基因，最终得到人参皂苷Rg1活性成分的作用靶点。

（二）人参皂苷Rg1和CML的交集靶点及互相作用网络构建

以“chronic myeloid leukemia”为关键 词 在GeneCards疾病数据库中检索，检索结果以“相关分数”进行取值，根据中位数筛选出合适的基因数量进行后续分析。与人参皂苷Rg1作用靶点通过Excel取交集，即为人参皂苷Rg1作用于CML的靶点。利用微生信网站绘制出化合物—疾病靶标的韦恩图。

（三）构建化合物—疾病蛋白互相作用网络

将共同靶点导入STRING11.0数据库，选择研究物种为“智人”，最低相互作用域值设为highest confidence≥0.4，隐藏游离靶点，获得靶点联系网络图，保存csv格式文件，将文件导入Cytoscape3.7.2软件构建PPI网络。

（四）化合物—疾病之间分子对接验证

利用RCSB PDB数据库查找MAPK1(ERK)蛋白的晶体结构，将Rg1的Mol2结构式与蛋白晶体结构导入AutoDock vina、Pymol软件中，检测疾病靶蛋白与小分子化合物之间结合能力。

（五）Western blotting检测p-ERK蛋白的表达

取2×106个K562放 入 培 养瓶，加入500μL 20μmol/L的Rg1，总液体体积为5mL Rg1浓度、时间筛选参考本课题组以往研究结果[8]。提取各组细胞总蛋白，测定总蛋白浓度，电泳、转膜、封闭后，加入p-ERK一抗4℃过夜，TBST缓冲液漂洗2次，加入二抗，室温反应2h，ECL增强发光试剂显色，凝胶成像系统曝光。

二、结果

（一）Rg1作用于CML的蛋白靶点

在PharmMapper数据库得到299个人参皂苷Rg1的作用靶点，将靶点去重后，经Uniprot数据库进行基因名称转换后、剔除重复基因、无效基因名得到290个有效靶点。

（二）CML相关靶点数据库构建及交集靶点的筛选

在GeneCards数据库中检索得到4560个CML的疾病相关靶点，根据“相关性得分”的中位数进行筛选，经三次取中位数后，最终将1141个靶基因纳入考虑范围。取人参皂苷Rg1和CML的靶点交集共得到93个疾病靶点，制韦恩图，见图1。

图1 人参皂苷Rg1于CML相关靶点韦恩图

（三）人参皂苷Rg1作用于CML的PPI网络构建

人参皂苷Rg1与CML的蛋白互做分析，见表1、图2。该网络共包含93个节点，333条边，平均节点度值为7.16，平均局部聚类系数为0.476。节点面积越大，颜色越亮代表度值越大。度值表示该靶点与其他靶点的关联个数，度值越大表明该靶点与其他作用靶点联系越紧密，在网络中的作用越重要。该93个共同靶点是Rg1作用于疾病的关键分子基础。其中SRC（癌基因酪氨酸蛋白激酶），MAPK1（丝裂原激活的蛋白激酶1），PIK3R1（磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基α），GRB2（生长因子受体结合蛋白2），HRAS（GTPase HRas），PTPN11（酪氨酸蛋白磷酸酶非受体11型），LCK（酪氨酸蛋白激酶），MAPK8（裂原激活的蛋白激酶8），IGF1（胰岛素样生长因子I）等度值排行前10的靶点均可与17个及以上靶点相互联系，提示这些靶点在治疗方面的重要性。

图2 PPI蛋白互作网络图

表 1 人参皂苷Rg1对AD作用靶点的拓扑学分析（前20位）

（四）分子对接结果

人参皂苷Rg1与MAPK1（ERK）进行对接，结合能为-7KJ/mol，一般认为配体与受体的结合能越低，其结合构象越稳定，发生的作用可能性越大。结合能小于0KJ·mol-1说明受体和配体可自发结合。见图3。

图3 分子对接

（五）Rg1对562细胞p-ERK相对蛋白表达量的影响

与对照组相比，Rg1组p-ERK蛋白表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图4。

图4 Rg1对562细胞p-ERK蛋白表达量的影响与对照组相比（P＜0.01）

三、讨论

本研究利用网络药理学和分子对接的方法，探讨了人参皂苷Rg1对CML的潜在作用机制。推测可能通过SRC、MAPK1、PIK3R1、GRB2、HRAS、PTPN11等度值排名较高的靶蛋白发挥治疗CML的作用。

SRC（原癌基因酪氨酸蛋白激酶）是非受体蛋白酪氨酸激酶，在肿瘤的迁移中起到重要重用[9]。粘着斑（FAs）的周期性形成和分解是肿瘤细胞迁移的基础。SRC已被证实为CML中的治疗靶点[10]。因此我们选择MAPK1（ERK）进行研究，MAPK1（丝裂原激活的蛋白激酶1），属于丝氨酸/苏氨酸激酶，它是MAP激酶信号转导途径的重要组成部分。通过调节转录、翻译、细胞骨架重排来介导多种生物学功能，例如细胞生长、粘附、转移和分化。李刚等研究表明，TUG-1可通过miR-370-3p/MAPK1/ERK信号通路，促进AML（急性髓样白血病）细胞的迁移和侵袭能力[11]。分子对接后证明Rg1能与此靶点蛋白自发结合。本课题组证明Rg1作用于K562细胞后能抑制其增殖，但具体机制尚不完全清楚，本文使用网络药理学后找出潜在靶点进行实验，western blotting结果显示，Rg1组p-ERK的表达明显降低，提示Rg1可以通过抑制p-ERK起到抗肿瘤的作用。

本研究通过网络药理学探究人参皂苷Rg1通过多靶点和多通路作用于白血病的分子机制。除了已知的靶点和通路，还挖掘出潜在的作用靶点，为后续的实验提供了理论依据。