贝莱斯芽孢杆菌Y6抗菌肽抑制白念珠菌活性的研究

杨成 乔云龙 厉荣玉 熊延靖 汤兴丽

[1.皖南医学院微生物学与免疫学教研室，芜湖 241002；2.活性生物大分子研究安徽省重点实验室(皖南医学院)，芜湖 241002；3.皖南医学院药学院，芜湖 241002]

白念珠菌(Candidaalbicans)，一种双相型真菌条件致病菌，通常不会引起临床症状，当应用广谱抗生素、激素和免疫抑制剂等造成机体免疫力下降时，可引起皮肤、黏膜等浅表感染，甚至侵犯深部组织和器官引发全身性感染，造成念珠菌病[1-5]。目前，临床上所用的抗真菌药物种类有限且长期大量使用会产生严重的耐药现象及毒副作用[6-8]。因此，在高效低毒抗真菌药物匮乏的情况下，亟待寻求和开发新型安全有效的抗真菌药物[9]。笔者前期研究分离到1株对白念珠菌具有明显拮抗作用的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，而通常芽孢杆菌的代谢产物中往往含有抗菌肽类活性物质，它们能够造成细胞膜的损伤，导致细胞内容物外泄而具有广谱抗菌、抗病毒、抗原虫和抗肿瘤等活性[10-11]。因此，本文以白念珠菌为指示菌，对菌株Y6抗菌肽类代谢物抑制白念珠菌及其作用机理进行初步研究，这不仅为抗真菌药物的开发提供了新的方向，同时也为进一步开发应用抗真菌活性肽提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株 标准质控菌株：白念珠菌(ATCC10231)购自上海鲁微科技有限公司；贝莱斯芽孢杆菌Y6由本实验室分离保存。

培养基 PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH，高压灭菌121℃、15 min；液体种子/发酵培养基(液体PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH，121℃、15 min；沙堡弱液体培养基：蛋白胨10 g、葡萄糖40 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH，121℃、15 min。

试剂和仪器 麦氏比浊管(北京威泰科生物有限技术公司)，碘化丙啶(PI)(合肥博美生物有限公司)，牛津杯(南京泰勒生物仪器有限公司)，薄层色谱板(TLC)(德国Merk公司)，薄层色谱制备板(青岛海洋)，ESCD CLASSⅡBSC生物安全柜(Airstream)；GWP-P80A型隔水式恒温培养箱(合肥华德利科学器材有限公司)，奥林巴斯IX71FL倒置荧光显微镜(日本)，冷冻离心机 (BECKMAN COULTER Allegra 64R Centrifuge)，恒温水浴震荡培养箱(上海跃进医疗器械厂)，Freeze Dry Systems(美国LABCONCO公司)。

1.2 方法

白念珠菌菌液的制备 挑取少许白念珠菌斜面接种于沙堡弱液体培养基中，于37℃、180 r/min 振荡培养24 h，3 000 r/min离心5 min，将菌体沉淀悬浮于无菌蒸馏水中，将其浓度调整至1个麦氏单位，4 ℃保存备用。

贝莱斯芽孢杆菌Y6代谢物制备及活性测定取斜面菌种1环到PDA 种子培养基中，37 ℃、180 r/min，20 h，按照10% 的接种量接入装有 200 mL PDA 液体发酵培养基的500 mL 摇瓶中，37 ℃、180 r/min，发酵培养48 h，将发酵液在 4 ℃下12 000 r/min离心30 min，去菌体收集上清液，121 ℃灭菌处理15 min后将上清液经0.22 μm过滤后冷冻干燥备用。

抗菌活性的测定 将1个麦氏单位白念珠菌用无菌棉棒直接涂布于PDA平板中，然后放入牛津杯，并让其自然下沉后，将冻干品制成浓度为10 mg·mL-1作为测试品，吸取100 μL至牛津杯，轻轻移至37 ℃恒温培养箱培养24 h，以无菌水溶液为对照，观察抑菌圈，并测量抑菌圈直径，重复3次，取平均值作为该样品抑菌结果；菌株拮抗性采用点接法，直接挑取菌株Y6点接于上述涂有白念珠菌PDA平板中，观察菌落周围是否出现抑菌环。

最小抑菌浓度(MIC)的测定 取上述浓度为1个麦氏单位白念珠菌用沙堡弱液体培养基稀释100倍后，取1 mL，向其中加入10 mg 菌株Y6代谢物，然后采用梯度稀释，使Y6代谢物的终浓度分别为5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125 mg·mL-1，37 ℃恒温培养箱培养 24 h，取50 μL白念珠菌悬液涂布于PDA平板中，于37℃恒温培养箱中培养36 h，观察各平板上白念珠菌生长情况，以没有白念珠菌菌落出现来确定MIC，重复3次。

菌株Y6代谢物中活性成分的筛检及活性的检测 将上述贝莱斯芽孢杆菌Y6代谢物冻干品用甲醇抽提，离心取上清液作为测试样品， 参照文献[12]进行试验，点样后在三氯甲烷∶甲醇∶水=15∶7∶2展开剂中展开，自然挥发干，在254 nm标记出被分离物质斑点位置，用制备板将各组分进行分离制备，将收集的组分用甲醇抽提点样跑板，254 nm下观察分离效果，然后用0.4%茚三酮乙醇溶液显色。采用滤纸片法对制备的活性成分进行抗菌活性测定，以甲醇为对照，观察各组分对白念珠菌的活性。

菌株Y6抗菌肽对白念珠菌细胞膜通透性的影响 参照文献[13-14]方法进行，取1个麦氏浓度白念珠菌悬液，用沙堡弱液体培养基稀释100倍后，加入菌株Y6抗菌肽，使其终浓度为0.5 MIC作为实验组，无菌水为对照组，将其置于摇床37℃ 150 r/min 进行培养，于0、4、8、12 h取出3 mL，5 000 r/min 离心10 min 分别收集上清液和菌体沉淀。其中上清液直接测量其在波长为260 nm和280 nm的吸光值，考察Y6代谢物对白念珠菌细胞内大分子(核酸OD260、蛋白质OD280)释放情况的影响。菌体沉淀用PBS 缓冲液洗涤3 次，离心弃上清，用沙堡弱液体培养基重悬菌体沉淀使其体积为200 μL，加入PI溶液，使混合液中 PI的终浓度达到20 μg·mL-1，混匀后4℃避光染色10 min，离心取菌液涂片，在荧光显微镜下观察并拍照，重复3次。

1.3 统计学处理

实验数据使用SPSS 17.0统计软件分析处理，采用方差分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 贝莱斯芽孢杆菌Y6代谢物对白念珠菌的抑制作用

Y6代谢物对白念珠菌抑制效果见图1所示，从测试结果可以看出，菌株Y6代谢物对供试的白念珠菌表现出有良好的抑制效果，当测试浓度为10 mg·mL-1，抑制圈直径分别为(38.2±0.5)mm，而左侧无菌水对照组没有出现抑菌现象(见图1A)；图1B显示该菌株在PDA培养基对白念珠菌的拮抗性试验结果，菌株Y6菌落周围出现明显抑菌圈，直径平均为(27.8±0.4)mm；图1C是将菌株、代谢物及无菌水对照在同一平皿中对白念珠菌的抑制活性结果。通过上述活性测定结果，表明菌株Y6对供试白念珠菌明显的抑制作用。

图1 菌株Y6代谢物抑菌白念珠菌的效果 图2 菌株Y6抗菌活性组分的筛检及抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect of metabolites of strain Y6 on C. albicansFig.2 Screening and antifungal effect of antimicrobial active components of strain Y6

2.2 最小抑菌浓度的测定

在最小抑菌浓度测定中，当菌株Y6代谢物浓度在10～0.625 mg·mL-1时，平板上未见白念珠菌菌落出现，随着加入菌株Y6代谢物浓度减小到终浓度为0.3125 mg·mL-1时开始出现少量菌落，据此初步判断，菌株Y6代谢物对白念珠菌的MIC为 0.625 mg·mL-1。

2.3 抗菌组分的分离纯化及其活性测试

在展开剂为三氯甲烷∶甲醇∶水=15∶7∶2条件下展开，测试样品初步分离情况如图2A(原)所示，其中1～5为制备后甲醇抽提组分，图2B所示为各分离组分0.4%茚三酮显色板。从A图结果可知，254 nm下测试样品(原)可见5个明显的斑点，分别对应制备分离后的样品(1～5)，只是4、5组分纯度更高，可见单一的斑点，而1～3组分有拖尾现象。而上述各组分经0.4%茚三酮显色后，组分1～3均呈现紫红色斑点，说明1～3组分为肽类物质，只是纯度不高，而紫外254 nm下相对较纯的4、5组分却没有产生紫红色斑点，表明组分4、5可能为非肽类物质。而图2C中抗菌活性测试结果表明制备组分中有2个抗菌活性组分，分别为组分2和组分5，其中2组分为主要活性部分，组分5仅仅显示微弱的抗菌活性，组分1、3、4及甲醇对照均没有抗菌活性，结合茚三酮显色结果，可以初步推断菌株Y6代谢物中抗菌成分主要为肽类物质。

2.4 菌株Y6抗菌肽对白念珠菌胞内大分子释放量的影响

细胞内的大分子物质通常不能透过细胞膜释放到细胞外，但如果细胞膜受损，胞内的核酸、蛋白质等大分子物质就可能会泄漏到细胞外，因此，通过检测经上清液在260 nm和280 nm处吸光度的变化来判断胞内核酸和蛋白质泄漏情况，结果见图3所示，随着作用时间的延长，处理组OD260 nm和OD280 nm吸光值明显高于对照组OD260 nm和OD280 nm吸光值，表明代谢物对胞内大分子释放量存在一定的影响，与对照组相比差异有统计学意义(FOD260 nm=13.822、FOD280 nm=10.549，P<0.05)，表明菌株Y6抗菌肽对白念珠菌细胞膜结构造成一定的影响，引起膜内物质泄漏到胞外，进而达到诱使菌体死亡的目的。

图3 抗菌肽对胞内大分子释放量的影响. A. 核酸释放量；B. 蛋白质释放量Fig.3 Effect of antimicrobial peptide on intracellular macromolecule release. A. The amount of nucleic acid released; B. The amount of protein released

2.5 PI荧光标记检测菌株Y6抗菌肽对白念珠菌细胞膜通透性的影响

由于许多芽孢杆菌抗菌肽类代谢物能通过诱导细胞膜完整性的变化来实施其生物学活性，PI荧光染料不能穿过完整的细胞膜，但可渗透到膜受损的细胞内，并与核酸结合，导致荧光增强，所以可用PI染料来检测细胞膜的完整性。菌株Y6抗菌肽对白念珠菌细胞膜通透性的影响结果如图4所示。对照组由于未加抗菌肽处理，菌体细胞膜仍处于完整状态，因此PI染料无法进入，荧光显微镜下除个别细胞外显红光外，绝大多数菌体细胞无红光出现(见图4对照组)，说明此状态下，由于个别白念珠菌细胞死亡胞膜结构发生变化，而绝大多数白念珠菌细胞膜通透性并没有发生改变，使得PI进入个别死亡细胞内而呈显红光；而经抗菌肽处理后，随着处理时间的变化，菌体细胞出现了的红光信号(见图4 处理组)，说明经抗菌肽处理后，白念珠菌细胞膜的完整性遭到一定程度的破坏。

图4 菌株Y6抗菌肽对白念珠菌细胞膜通透性的影响(1、2 分别为明视野和相同位置荧光视野可观察到的荧光显微镜图，×400)Fig.4 Effect of antimicrobial peptide from strain Y6 on membrane integrity of C.albicans(1 and 2 are fluorescence microscopes that can be observed in the bright field and the same position，×400)

3 讨 论

近年来真菌感染的发病率上升，真菌耐药性亦有增加，可用抗真菌药物的数量有限，使得研发新型安全、有效的抗真菌药物更为迫切[15]。抗菌肽是一类具有抗菌活性的多肽类小分子，分布广泛，结构简单，不仅对细菌有很强的杀伤作用，而且对真菌、病毒、寄生虫及肿瘤细胞等都有一定的杀灭活性[16-17]。本实验以探究贝莱斯芽孢杆菌Y6代谢物对白念珠菌抑菌效果为目的，进而研究抗菌的作用机理，结果表明，通过牛津杯法，贝莱斯芽孢杆菌Y6代谢物对白念珠菌表现出明显的抑菌效果，当代谢物测试浓度度为10 mg·mL-1，抑制圈直径为(38.2±0.5)mm，其MIC 为 0.625 mg·mL-1，结合平板对峙法发现贝莱斯芽孢杆菌Y6对白念珠菌也表现出明显的拮抗性，菌落周围抑菌环直径达到(27.8±0.4)mm。为了进一步探究菌株Y6代谢提取物对白念珠菌的抑制效果，采用薄层色谱法对代谢物中的抗菌成分进行初步分离纯化，结果发现菌株Y6代谢物在薄层板上254 nm下显示出5个明显的斑点且在茚三酮作用下1～3号分离组分呈紫色，4～5号没有显出颜色，推断Y6代谢产物1～3号为肽类代谢物，而4～5号组分为非肽类物质；通过抑菌活性测试，结果发现代谢物中有2号组分对白念珠菌具有非常显著的抑制作用，综合上述实验结果，表明Y6代谢物中主要对白念珠菌产生抑制作用为肽类代谢物。由此推测该肽类抗菌活性可能与其损伤细胞膜作用有关，通过大分子释放量及PI荧光染色考察抗菌肽物质对白念珠菌细胞膜完整性的影响，通常细胞内大分子物质不能透过细胞膜释放到细胞外，但如果细胞膜受损，胞内的核酸、蛋白质等大分子物质就可能会泄漏到胞外，因此，通过检测大分子释放量可以间接了解细胞膜的损伤程度，试验结果发现菌株Y6抗菌肽类代谢物能增加胞内大分子释放量，这一结果与郭娟等[13]所描述的“抗菌肽P-1可引起粉红单端孢细胞膜通透性增加，胞内大分子物质外泄”结论相似。PI为一种核酸染料，一般不能进入具有完整细胞膜的细胞中，当细胞膜通透性增加或细胞死亡时，它能进入细胞与核酸特异性结合，发出红棕色荧光，结合越多PI，荧光强度越强，PI摄入试验结果与蔡蜨等[14]报道结果相似，通过荧光显微镜观察，还发现经抗菌肽处理可破坏白念珠菌细胞膜，使PI 荧光染色剂进入菌体内与核酸物质结合，发出红光，通过大分子释放量变化及PI摄入量的变化实验，都表明抗菌肽类代谢物处理后白念珠菌胞膜完整性受到一定程度的影响。由此推测，贝莱斯芽孢杆菌Y6抗菌肽类代谢物对白念珠菌具有抑制活性，且该活性与其对白念珠菌胞膜的破坏之间存在密切的关系。