盈江澳洲坚果黑果病病原鉴定及防治药剂室内筛选

蒋桂芝，王 康，李学斌，贺熙勇*

（1.云南省热带作物科学研究所，云南景洪 666100；2.云南迪思企业集团坚果有限公司，云南盈江 679300）

坚果纳入云南省高原特色农业规划和“十三五”木本油料发展规划中，盈江县成为云南澳洲坚果的产地之一［1］。澳洲坚果是外来引进物种，国内对澳洲坚果的研究起步晚，种植模式、栽培环境与原产地有较大差异。由于栽培环境、管理模式的不同，导致病虫害的发生情况与原产地也不尽相同。如近年来发生越来越严重的澳洲坚果黑果病（又称炭疽病），据云南盈江迪思企业集团坚果有限公司的产量损失统计：2019 年损失23 t，2020 年损失53 t，2021 年损失达113.5 t。

澳洲坚果黑果病常发生于每年雨季6—8 月，果实正处于养分积累期至成熟期，未成熟的果实感病后脱落，造成产量损失严重，并且黑果病发生严重的果园常发生叶枯病。澳洲坚果原产地澳大利亚有报道，引起果斑病的病原菌有炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、拟茎点霉Phomopsissp.、束梗尾孢菌Pseudocercospora、毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae等，Pseudocercospora通常在开花后4～5 个月引起病态早熟的果实脱落［2］；由束梗孢菌Stilbella cinnabarina引起果壳斑点病可造成大量的熟前落果，该病发生在长期潮湿的季节［3］；笔者曾报道国内由橡胶疫霉Phytophthora heveae引起的果腐病［4］，以及在云南景洪引起澳洲坚果果实褐斑病发生的是Calonectria pentaseptata［5］。2019—2021 年，课题组在云南省盈江县进行调查、采样和鉴定，分析该病害发生的环境条件以及控制黑果病的技术措施，以明确黑果病的致病菌和防治的化学药剂，为云南澳洲坚果黑果病的大田防控提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

病原菌分离材料取自云南省盈江县迪思坚果公司莲花山基地（N24°46′37″，E97°55′35″，海拔956 m）、太平镇基地（N24°38′47 ″，E97°47′24 ″，海拔1 043 m）及云南源润坚果开发有限公司基地（N24°42′49 ″，E97°56′10 ″，海拔936 m）。

真菌菌丝DNA 快速抽提试剂盒、ITS1/ITS4、HIS3、β-tubulin 等PCR 扩增引物，由 生工生物工程（上海）技术服务有限公司提供。

试验接种材料为澳洲坚果未成熟果实，农业部景洪澳洲坚果种质资源圃提供。

参试药剂：（1）50%多菌灵WP（江苏蓝丰生物化工股份有限公司），（2）450 g/L 咪鲜胺EW（江苏辉丰农化股份有限公司），（3）200 g/L 氟唑菌酰羟胺SC（先正达南通作物保护有限公司），（4）250 g/L 嘧菌酯SC（先正达南通作物保护有限公司），（5）44%苯甲·百菌清SC（4%苯醚甲环唑，40%百菌清；先正达南通作物保护有限公司），（6）36%丙环·咪鲜胺SE（10%丙环唑，26%米鲜胺；浙江天丰生物科学有限公司），（7）60%唑醚·代森联WG（5%吡唑醚菌酯，55%代森联；巴斯夫植物保护（江苏）），（8）500 g/L 甲基硫菌灵SE（江苏龙灯化学有限公司），（9）325 g/L 苯甲·嘧菌酯SC（先正达南通作物保护有限公司），（10）40%吡唑醚菌酯·喹啉铜SC（10%吡唑醚菌酯，30%喹啉铜；江西中迅农化有限公司），（11）75%唑醚·甲硫灵WP（15%吡唑醚菌酯，65%甲基硫菌灵；江苏龙灯化学有限公司），（12）10%苯醚甲环唑WG（先正达南通作物保护有限公司），（13）75%肟菌·戊唑醇WG（25%肟菌酯，50%戊唑醇；拜耳作物科学中国有限公司），（14）20%噁霉·乙蒜素WP（5%噁霉灵，15%乙蒜素；南阳新卧龙生物化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离

将病果用自来水清洗，晾干后用75%乙醇表面消毒处理30 s，剖开病果，选择病健交界组织，分别挑取大小2～3 mm×2～3 mm 的组织分别放置在PDA 平板上，在25℃、RH65%条件下培养5 d，将得到的菌落镜检、单孢分离，得到纯培养菌株用于致病性试验，并将菌株与病果上镜检结果进行比对。

1.2.2 致病性测定

将培养10 d 的测试菌株孢子制成浓度为1×103个/mL 的孢子悬浮液备用。在果园选取20 个正常未成熟带皮果，其中10 个喷孢子悬浮液1 mL/个，10 个作对照喷无菌水1 mL/个，处理后均分别放置于20～28℃、RH85%条件下的保湿缸中保湿。当接种带皮果出现与田间一致的感病症状后，再进行病原分离，得到与接种菌一致的菌，即确认为病原菌。

1.2.3 病原菌鉴定

（1）形态学鉴定

病果上霉状物镜检：用灭菌牙签挑取病果表层霉状物少许，放在载玻片上，加灭菌水，盖上玻片，在显微镜下观察霉状物的形态特征。

将纯培养病原菌在PDA 培养基上培养5～7 d，观察形态特征、产孢方式等，依据Crous［6］、庄文颖［7］等的方法进行鉴定。

（2）分子生物学鉴定

按照Fungal DNA Kitr 的提取步骤，提取菌丝的DNA 置 于4℃冰箱中备用。用ITS1/ITS4［8］、HIS3［9］、β-tubulin［10-12］等序列引物进行PCR 扩增，扩增产物送交生工生物工程（上海）技术服务有限公司完成测序。将获得的ITS、HIS3、TUB2 序列上传至GenBank 数据库，并与GenBank 数据库中有关序列进行同源性比较，应用MEGA 7.0 软件对拼接序列进行对比分析，构建rDNA-ITS-HIS-TUB序列多基因联合系统发育树，确定其分类学地位。

1.2.4 药剂毒力测试

各参试药剂的使用浓度选用药剂说明推荐使用浓度的中间浓度。各参试农药配制成含毒培养基，对照为空白（不加任何农药）。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离、致病性的测定

分离样本18 个，得到18 个菌落。经观察菌落和分生孢子形态初步鉴定，其中15 个菌落均为同一种真菌，分生孢子形态与病果上霉状物镜检结果一致。选取代表性菌落进行单孢分离，经过多次转移培养，获得了一些菌落和孢子完全一致的纯培养物，编号为OJ20190628。从PDA 上培养10 d 的纯培养物中获得孢子制备浓度为1×103的孢子悬浮液。

孢子悬浮液接种2 d 后，带皮果表面开始出现点状水渍斑，5 d 病斑已扩大变成黑色，病斑边缘呈水渍状，有的病斑上开始出现白色霉状物，病状与田间一致；对照无症状。从有症状的果实中重新分离到与接种一致的真菌，确认菌株OJ20190628 对澳洲坚果果实有致病性。

2.2 病原菌鉴定

2.2.1 形态学鉴定

病果上霉状物镜检：霉状物为菌丝体和分生孢子，分生孢子棒状，有5 个隔，大小66～72 μm×5.2～6.0 μm。

菌株OJ20190628 在PDA 上菌丝白色，老熟菌丝棕色至红棕色（图1，a）。在PDA 上产生大量分生孢子，分生孢子圆柱形（图1，b，c），长 61～81 μm，宽 4.3～6.3 μm，有5 个隔。厚垣孢子褐色或棕褐色，串生或聚生，近球形、椭圆形及长圆柱形（图1，d）。分生孢子梗有大型分生孢子梗和小型分生孢子梗，大型分生孢子梗由总梗、帚状可育分枝、伸延梗和顶生囊泡组成；分生孢子总梗有隔，长50～145 μm，宽5.6～9.0 μm；伸延梗有隔（图1，e），直或弯曲，长190～340 μm，宽3.1～5.5 μm，终止于棒状的囊泡；棒状的囊泡宽3.1～5.0 μm。帚状可育分枝常3 级分枝（图1，f），偶见4、5 级分枝，孢子梗长49～100 μm，宽6～9 μm；1 级分枝0～1 隔，长16～33 μm，宽3～6 μm；2 级分枝0～1 隔，长17～29 μm，宽4～6 μm；3 级分枝无隔，长14～22 μm，宽3～6 μm，每个末端分支产生1～3 瓶梗，瓶梗无隔，圆柱形至腊肠状，单生时倒梨形，长12～23 μm，宽 3～6 μm。基于这 些形态特征，OJ20190628 鉴定为丽赤壳菌属Calonectria pseudoreteaudii。

图1 OJ20190628菌株的形态特征

2.2.2 分子鉴定

从菌丝体中提取DNA 基因组，通过3 对引物对ITS1/ITS4、HIS3、β-tubulin 片段进行PCR 扩增、测序，分别获得521 bp ITS（MN906306）、450 bp HIS3（MT052331）、331 bp TUB2（MT052332）等 序列，在NCBI 网站上进行同源性比较，通过BLAST搜索核酸数据库显示，这些序列分别与已报道的Ca.pseudoreteaudii系列中的FAFU201101 菌株的ITS（JN794044）、HIS3（JN975409）和TUB2（JN975408）序列同一性分别为100%，100%和99.6%。通过MEGA7 软件构建病原菌OJ20190628 的rNDA-ITSHIS-TUB 多基因联合与近源物种的系统发育树，结果显示病原菌OJ20190628 与Ca.pseudoreteaudii位于同一分枝，支持率为100%（表1、图2）。

图2 OJ20190628基于rNDA-lTS-HlS 多基因联合与近源物种的系统发育树

表1 参考菌株名称、馆藏号和GenBank登录号

形态学和分子鉴定分析表 明病原 菌OJ20190628 是Ca.pseudoreteaudii。

2.3 药剂毒力测试

试验结果（表2）表明，参试的14 种药剂中有8 种药剂对病原菌菌丝的生长抑制率达50%以上，分别是唑醚·甲硫灵、多菌灵、甲基硫菌灵、丙环·咪鲜胺、氟唑菌酰羟胺、肟菌·戊唑醇、咪鲜胺、吡唑醚菌酯·喹啉铜，其中抑制率达75%以上有多菌灵、甲基硫菌灵、唑醚·甲硫灵、丙环·咪鲜胺、氟唑菌酰羟胺、肟菌·戊唑醇等6 种药剂防治黑果病；噁霉·乙蒜素、苯甲·百菌清、嘧菌酯、苯甲·嘧菌酯、苯醚甲环唑等6 种药剂的生长抑制率低于50%。

表2 不同药剂对病原菌菌丝生长的影响

3 讨论

由Calonectria pseudoreteaudii引起澳洲坚果果实黑斑病为首次报道。由Ca.pseudoreteaudii引起植物病害的报道不多见，目前已报道Ca.pseudoreteaudii是桉树焦枯病的病原菌之一［13-14］。丽赤壳属Calonectria无性型为帚梗柱孢霉属Cylindrocladium，但由Cylindrocladium引起植物病害的报道并不多见。在云南景洪引起澳洲坚果果实褐斑病发生的是Ca.Pentaseptata［15］，在德宏引起黑果实病的是Ca.pseudoreteaudii，Ca.pentaseptata与Ca.pseudoreteaudii为同属不同种，或许是因为地域差异导致的种间差异，是否也表明在我国澳洲坚果种植区造成果实病害的Ca.pentaseptata与Ca.pseudoreteaudii这两种病原菌具有明显的区域性为害特征，即Ca.pentaseptata与Ca.pseudoreteaudii引起的果实病害为我国澳洲坚果种植区所特有的一种新病害。

在调查过程中还发现，这两种病原菌除引起澳洲坚果的果实感病外，还可引起叶斑、叶枯，严重的造成枝条回枯，说明这两种菌对澳洲坚果果树的危害不可忽视，或许还有一些潜在的危害可能尚未被发现，这两种菌有可能成为云南澳洲坚果栽培过程中重要的病原菌。

Ca.pseudoreteaudii产孢最适温度为25℃，孢子萌发最适温度为28℃，孢子萌发与相对湿度成正相关，黑暗有助于孢子萌发［16］，这些特性与澳洲坚果黑果病发生的环境高度相吻合。澳洲坚果黑果病发生在高温、高湿的雨季，病害传播速度快，因而要控制黑果病的发生就必须改善果园的环境条件，即降低果园的湿度，增加果园的通风透光，进入发病期采用化学药剂控制。

4 结论

澳洲坚果黑果病主要发生在高温、高湿的雨季6—8 月，种植过密、荫蔽度较高的果园易发生黑果病流行，控制该病害发生流行应采用综合防治措施：第一建立病虫害监测；第二加强果园修剪、施肥等田间管理；第三预防为主，进入雨季出现第一次连续降雨后适时采用化学药剂防治，化学药剂防治推荐使用唑醚·甲硫灵、多菌灵、甲基硫菌灵、丙环·咪鲜胺等4 种常见药剂。