游离钙离子在‘砀山酥’梨“铁头病”发病过程中的作用研究*

刘肖烽，李舒然，李六林

（山西农业大学园艺学院，太谷 030801）

‘砀山酥’梨种植面积广，是我国优良的梨品种[1]。但是近几年来在‘砀山酥’梨果实上发现果顶部位异常坚硬且明显突出，失去商品价值，俗称“铁头病”。田间调查发现，该病害发病率为30%～40%，成为威胁‘砀山酥’梨生产的一大病害。因此，阐明“铁头病”的发生原因、寻求有效的解决方案对‘砀山酥’梨产业发展具有重要意义。

笔者研究发现“铁头病”果实硬化的关键时期为盛花期后34 d，主要表现在木质素的大量合成导致石细胞急剧增加。木质素是植物防御胁迫的重要物质[2]，当遇到各种生物和非生物胁迫时，会有更多的木质素沉积在细胞次生壁上，使得细胞变厚，最终导致果实硬度增加[3]。此外，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、肉桂醇脱氢酶（CAD）是木质素合成过程中重要的酶[4]，其活性升高会使得木质素合成速率加快。‘砀山酥’梨果实木质素的过度沉积会导致石细胞的形成[5]，严重影响果实品质[6]。

钙（游离钙离子）对植物抗性提高[7]、细胞壁形成[8]、果实发育和品质形成[9]具有重要作用。有研究认为，在果实采收前喷施CaCl2可以降低果实木质素含量，提高果实品质[10]。钙（游离钙离子）是细胞壁的构成成分[9]，是否对木质素合成和沉积发挥作用还未见相关报道。本试验通过花期在“铁头病”果园中喷施2%CaCl2，以及在正常果园中喷施游离钙离子螯合剂EGTA，以盛花期后34 d和151 d的果实为试验材料，对不同处理后果实游离钙离子含量、木质素含量、石细胞密度和木质素合成相关酶活性进行测定，同时对游离钙离子和石细胞的分布情况进行观察，以探索游离钙离子对‘砀山酥’梨“铁头病”的缓解作用，为该病害的防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采样地点位于山西省晋中市祁县修善村，果园常规管理，供试梨品种为‘砀山酥’，树龄10年，行株距为3 m×2 m。

1.2 试验处理与方法

提前在“铁头病”发生严重的果园中标记发病树，并且标记发病枝条，选择病果分布均匀的梨树5株，喷施浓度为2%的CaCl2溶液，另选择5株树喷施等量清水作为对照（发病果园）；在正常果园中随机选择正常发育的梨树5株，喷施浓度为3 mmol/L的EGTA，同时选择5株树喷施等量清水作为对照（正常果园）。每株树喷施1.5 L，均匀喷洒至树体表面（喷施前后4 h内如遇降雨需补喷），共喷施3次，具体时间为4月10、15、20日。

（1）发病率的测定。2019年5月24日，每处理选择5株树，采用大枝统计法，每株树随机选择3个大枝（果实总数大于100个），分别统计各处理的病果数（果实果顶部位明显凸出的即为病果），计算发病率。

发病率（%）=（病果总数/调查总果数）×100

（2）果实品质及次生代谢物含量测定。2019年9月18日，每处理选择5株树，每株树从树冠外围采集果实30个，采集的果实分别从果肩与果顶部位取样。用GY-3型硬度计测定果实硬度，用WYT-4手持糖度计[11]测定可溶性固形物含量，用蒽酮比色法[12]测定可溶性糖含量，用酸碱滴定法[13]测定可滴定酸含量，采用烘干法测定[14]果实含水量。木质素含量采用Klason法[15]进行测定，石细胞含量采用于娟娟等[16]的方法测定；PAL、C4H、CAD活性参照王丹阳[4]的方法测定，4CL活性的测定参照王斌等[17]的方法；果实游离钙离子含量的测定参照赵静等[18]的方法。

（3）组织结构观察。Ca2+定位参照Wang等[19]的方法进行。用石蜡切片、番红-固绿双重染色对石细胞进行观察[20]。

1.3 数据处理

试验数据用Excel 2010和SAS v9.0软件进行统计和方差分析。

2 结果与分析

2.1 外施CaCl2及其抑制剂对发病率的影响

如图1所示，发病果园“铁头病”发病率高达37.53%，而正常果园未发现病果。发病果园喷施CaCl2后，“铁头病”发病率显著降低，为24.67%。对正常果园喷施EGTA后，出现极少量病果。

图1 不同处理果园“铁头病”发病率

2.2 外施CaCl2及其抑制剂对果实品质的影响

2.2.1 对果实硬度的影响

发病果园病果果肩和果顶部位硬度分别为11.27、21.00 kg/cm2，显著高于其他处理；CaCl2处理的果肩、果顶硬度均显著低于病果相应部位，分别为9.50、16.70 kg/cm2；正常果实的果肩和果顶部位硬度分别为7.73、7.40 kg/cm2，与EGTA处理相应部位无显著差异（图2）。

图2 不同处理‘砀山酥’梨果实硬度

2.2.2 对果实可溶性固形物含量的影响

正常果实果肩和果顶的可溶性固形物含量分别为12.33%和11.93%，显著高于病果和CaCl2处理的相应部位；CaCl2处理的可溶性固形物含量高于病果，果顶的差异达显著水平；EGTA处理的可溶性固形物含量与正常果实差异不显著（图3）。

图3 不同处理‘砀山酥’梨果实可溶性固形物含量

2.2.3 对果实可溶性糖含量的影响

如图4所示，正常果实果肩、果顶的可溶性糖含量分别为90.12、85.47 mg/g，与EGTA处理相应部位均无显著差异，但均显著高于病果和CaCl2处理的相应部位；CaCl2处理果肩、果顶的可溶性糖含量均高于病果相应部位，果顶的差异达显著水平。

图4 不同处理‘砀山酥’梨果实可溶性糖含量

2.2.4 对果实可滴定酸含量的影响

如图5所示，CaCl2处理果肩和果顶的可滴定酸含量分别为0.23%、0.24%，显著低于病果相应部位；EGTA处理的果实果顶可滴定酸含量为0.17%，显著高于正常果实果顶（0.14%）。

图5 不同处理‘砀山酥’梨果实可滴定酸含量

2.2.5 对果实含水量的影响

正常果实的果肩、果顶含水量分别为87.49%、86.06%，显著高于CaCl2处理（85.16%和81.50%）和病果（84.57%和80.51%）相应部位；CaCl2处理后果实含水量较病果显著提高（图6）。

图6 不同处理‘砀山酥’梨果实含水量

2.3 外施CaCl2及其抑制剂对果实游离钙离子含量及分布的影响

2.3.1 对果实游离钙离子含量的影响

正常果实果肩游离钙离子含量达到0.39 mg/g，显著高于病果及CaCl2、EGTA处理的果实，其中CaCl2处理和EGTA处理间差异不显著，但均显著高于病果。正常果实和EGTA处理果顶的游离钙离子含量无显著差异，均显著高于CaCl2处理，CaCl2处理显著高于病果（图7）。

图7 不同处理‘砀山酥’梨果实游离钙离子含量

2.3.2 对果实游离钙离子分布的影响

从图8可以看出，正常果实果肩与果顶部位的游离钙离子分布密集，而病果果肩与果顶部位的游离钙离子分布极其稀少，经CaCl2处理的果实果肩与果顶游离钙离子分布稍有增加，而EGTA处理的果实果肩和果顶游离钙离子分布密集程度明显低于正常果实，但是明显高于病果与CaCl2处理的相应部位。

图8 不同处理‘砀山酥’梨果实游离钙离子定位状况

2.4 外施CaCl2及其抑制剂对果实次生代谢的影响

2.4.1 对果实石细胞含量和木质素含量的影响

对各处理果实不同部位石细胞的观察及其含量测定发现，正常果实与EGTA处理果实果肩、果顶的石细胞密度差异均不明显，其石细胞含量均显著低于病果和CaCl2处理相应部位；CaCl2处理果实果肩、果顶的石细胞密度均明显低于病果，其石细胞含量均显著低于病果相应部位（图版2、图9）。

如图9所示，果肩、果顶的木质素含量从低到高均依次为正常果实、EGTA处理、CaCl2处理、病果，且差异均达显著水平，说明CaCl2处理能显著降低病果的木质素含量，而EGTA处理能显著促进正常果实产生木质素。

图9 不同处理‘砀山酥’梨果实石细胞含量及木质素含量

2.4.2 对果实木质素相关酶活性的影响

由图10可以看出，CaCl2处理的果实果肩、果顶PAL活性均较病果相应部位显著降低，但均显著高于EGTA处理和正常果实相应部位，EGTA处理的果肩、果顶PAL活性均显著高于正常果实相应部位。CaCl2处理的果实果肩和果顶的4CL、C4H活性均较病果相应部位显著降低，但均显著高于EGTA处理和正常果实相应部位；EGTA处理的果肩4CL、C4H活性均显著高于正常果实，果顶4CL、C4H活性均与正常果实差异不显著。CaCl2处理的果实果肩CAD活性与病果果肩差异不显著，果顶CAD活性较病果果顶显著降低，但均显著高于EGTA处理和正常果实相应部位；EGTA处理的果肩与果顶CAD活性与正常果实相应部位均无显著差异。

3 讨论与结论

图10 不同处理‘砀山酥’梨果实PAL、4CL、C4H和CAD的活性

钙对植物体各种生命活动的正常进行有着不可估量的作用，包括增加植物的抗性、在外部刺激下作为信号分子调动内部相应的信号转导，同时还参加植物体细胞壁的构建[21-22]。Ca元素对于果实的生长发育同样有着重要的作用，果实中的游离钙离子对果实品质的形成以及采后果实品质的维持具有重要意义[23]。通过对正常果实与“铁头病”果实各部位游离钙离子含量分析发现，正常果实果肩与果顶游离钙离子含量均显著高于病果相应部位。在花期对患病果树连续喷施2%CaCl2溶液后，“铁头病”发病率显著降低，且经过处理的病果果肩与果顶游离钙离子含量均显著高于未处理的病果相应部位，但是都显著低于正常果实相应部位。对正常果实、“铁头病”果实、CaCl2处理果实各部位进行游离钙离子定位观察也得到了一致的结果，说明在花期连续喷施2%CaCl2可以对“铁头病”果实起到补充游离钙离子的作用。

木质素是由4-羟基苯基丙烷氧化组合偶联形成的芳香族聚合物[24-25]。这些聚合物主要沉积在细胞次生壁中，使细胞变得僵硬，进而显著增加了果实硬度[26]。同时石细胞的增加与果实硬度的提升也有着非常大的关系，而石细胞的形成与木质素在细胞壁上的积累导致次生壁增厚有决定性的关系，因此木质素在很大程度上影响着果实硬度[5]。经过2%CaCl2处理的果实石细胞含量和木质素含量均显著低于未处理病果，组织结构观察也显示CaCl2处理的果实石细胞密度小于病果，说明外源CaCl2处理降低了病果中木质素和石细胞的堆积，这与Lu等[10]的研究结果一致。经过2%CaCl2处理的病果PAL、4CH、C4L、CAD活性基本显著降低，这有利于减少果实中木质素的积累，缓解病情。石细胞含量与果实可溶性糖含量和水分含量呈显著负相关，与果实可滴定酸含量呈显著正相关[27-31]。本研究结果表明，病果的可溶性固形物含量、可溶性糖含量、含水量均显著低于正常果实，果实硬度、可滴定酸含量均显著高于正常果实。经过CaCl2处理后，病果果实品质得到改善，其果实可溶性固形物含量、可溶性糖含量、含水量均明显提高，果实硬度、可滴定酸含量均显著降低。其原因可能是花期喷施CaCl2，病果缺钙症状得到缓解，木质素含量显著降低，进而减少了石细胞的合成，改善了果实品质。

EGTA是游离钙离子螯合剂，可以与游离钙离子结合，与植物体竞争游离钙离子，使果实游离钙离子含量降低[32-33]。花期在正常‘砀山酥’梨园中连续喷施EGTA溶液，阻碍植株对游离钙离子的吸收，结果发现果实游离钙离子含量明显降低，木质素含量显著升高，果顶部位石细胞含量显著升高，果实品质变劣。

综上所述，‘砀山酥’梨果实游离钙离子含量的缺乏会使木质素过度沉积，导致石细胞大量合成，这可能是诱发“铁头病”的重要原因。可通过喷施2%CaCl2降低“铁头病”发病率以及缓解其发病程度。但是果实缺乏游离钙离子的原因以及喷施CaCl2对“铁头病”作用的机理还需进一步研究。