血清miR-21、miR-135a对胃癌患者化疗后复发和转移的预测价值

梁春芳，朱康宁，张 琦

（河南省人民医院 省直第一医院检验科，河南 郑州 450000）

胃癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，发生率和病死率均较高。我国胃癌发病率较高，因胃癌患者初期无明显特征，早期筛查的诊断率较低，待确诊时大多已处于中晚期[1]。目前，胃癌的主要治疗方法为化疗，但有超过50%的患者会出现复发和转移[2]。胃癌的发生、发展是一个极其复杂的过程，与一些原癌基因和抑癌基因异常表达密切相关[3]。因此，寻找异常表达的小分子，对胃癌的发生、发展及预后评估有重要的意义。miRNA是由22～24个核苷酸构成的单链非编码RNA分子，广泛分布于真核生物中，调控哺乳动物1/3的基因表达[4]。miRNA的异常表达与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，主要作用为调控癌基因或抑癌基因[5]。有研究结果显示，miR-21在肝癌[6]、胃癌[7]和乳腺癌[8]等肿瘤中呈异常表达，主要通过与目的基因的特异性结合，阻断其转录来调控基因的表达。miR-135a与消化系统肿瘤，如胃癌、结直肠癌和胰腺癌密切相关，主要通过抑制抑癌基因的活化来调控消化系统肿瘤的发生、发展[9-11]。这提示miR-21和miR-135a与胃癌有密切联系，化疗后检测患者miR-21和miR-135a的表达或可用于评估胃癌患者的早期复发和转移风险。为此，本研究拟探讨胃癌患者血清miR-21、miR-135a表达与化疗后复发、转移的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2016年1月—2018年1月河南省人民医院行化疗的胃癌患者100例（胃癌组），其中男62例、女38例，年龄38~77岁。肿瘤部位包括贲门（22例）、胃体（34例）、胃窦（31例）、全胃（13例）；病理类型包括单纯腺癌（55例）、印戒细胞癌（10例）、黏液腺癌（6例）、混合型（29例）；参考国际抗癌联盟及美国肿瘤联合会发布的胃癌TNM分期标准[12]进行TNM分期：ⅠB期8例、Ⅱ期15例、ⅢA期28例、ⅢB期22例、ⅢC期27例。另选取同期河南省人民医院健康体检者50名（正常对照组），其中男29名、女21名，年龄38～77岁。2个组之间年龄、性别差异均无统计学意义（P>0.05）。本研究经河南省人民医院伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：（1）以病理学检查结果为诊断标准；（2）入组前未经过放疗或化疗等治疗；（3）临床资料和随访资料齐全，且签署知情同意书。

排除标准：（1）术前曾接受手术、辅助化疗或放疗；（2）肿瘤类型为肉瘤、间质瘤或淋巴瘤；（3）化疗过程中死亡；（4）患可经血液传播的传染性疾病。

1.3 随访

在化疗后1个月开始对患者进行随访，每个月采用电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）复查1次，如出现复发或转移征象，则通过磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、正电子发射断层显像（positron emission tomography，PET）/CT和淋巴结穿刺等方法确诊。从2016年2月开始，对患者进行24个月的随访。随访第12个月、第14个月和第18个月各失访1例。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）

采集所有患者化疗前和化疗后第3、8、13、18、24个月的空腹静脉血10 mL，采集正常对照者体检当日的空腹静脉血10 mL，4 ℃1 000×g离心15 min后，分离血清，置于-80 ℃保存待检。采用Trizol LS试剂盒（美国Invitrogen公司）提取血清总RNA，采用NanoDrop 2000分光光度计（美国ThermoFisher Scientific公司）检测总RNA的纯度和浓度。将胃癌组与正常对照组的RNA浓度调至一致，再使用miRNA 第一链 cDNA 合成（加尾法）试剂盒将RNA逆转录（37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min）为cDNA。采用实时荧光定量PCR检测miR-21和miR-135a表达。引物序列见表1。扩增条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-21和miR-135a的相对表达量。

表1 引物序列

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0软件和Graphpad 5软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，2个组之间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价miR-21和miR-135a判断胃癌预后的效能。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组与正常对照组血清miR-21和miR-135a相对表达量比较

与正常对照组比较，胃癌组化疗前血清miR-21相对表达量升高（P<0.05），miR-135a相对表达量降低（P<0.05），见表2。胃癌组中有79例（79%）miR-21表达升高，有68例（68%）miR-135a表达降低。

表2 胃癌组与正常对照组血清miR-21和miR-135a相对表达量比较

2.2 血清miR-21和miR-135a相对表达量与胃癌患者临床病理特征的关系

胃癌组化疗前血清miR-21和miR-135a相对表达量与淋巴结转移、分化程度、浸润深度有关（P<0.05），与年龄、性别、TNM分期、有无远处转移无关（P>0.05）。见表3。

表3 胃癌组血清中miR-21和miR-135表达水平与临床特征的关系

2.3 胃癌组化疗后复发转移患者血清miR-21和miR-135a相对表达量

100例胃癌患者化疗后随访24个月，失访3例。97例完成随访的患者中有66例（68%）出现复发或转移（复发转移组），其中25例为局部复发、41例为远处转移，有33例死亡。未出现复发或转移的患者归入无复发转移组。

复发转移组化疗后3、8、13、18和24个月的血清miR-21相对表达量高于无复发转移组（P<0.05），miR-135a相对表达量低于无复发转移组（P<0.05）。复发转移组化疗后血清miR-21相对表达量随随访时间的延长而升高（P<0.05），血清miR-135a相对表达量随随访时间的延长而降低（P<0.05）。无复发转移组血清miR-21相对表达量随随访时间的延长而降低（P<0.05），血清miR-135a相对表达量各时间点差异均无统计学意义（P>0.05）。见表4、表5。

表4 复发转移组与无复发转移组各随访时间点血清miR-21相对表达量比较

表5 复发转移组与无复发转移组各随访时间点血清miR-135a相对表达量比较

2.4 miR-21和miR-135a单项检测及联合检测判断胃癌化疗后复发转移的效能

以患者出现复发或转移作为阳性（预后不良，66例），无复发或转移作为阴性（31例），采用ROC曲线分析随访24个月时的miR-21和miR-135a检测结果判断胃癌预后的效能。结果显示，miR-21和miR-135a判断胃癌预后的曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.789、0.826，最佳临界值分别为1.27、1.88。以随访24个月时的miR-21和miR-135a检测结果均阳性为联合检测阳性，均阴性为联合检测阴性，miR-21+miR-135a联合检测判断胃癌预后的敏感性和特异性分别为91.2%和67.8%。见表6、图1。

图1 随访24个月时的miR-21和miR-135a判断胃癌化疗后复发转移的ROC曲线

表6 随访24个月时的miR-21和miR-135a单项检测和联合检测判断胃癌化疗后复发转移的效能

3 讨论

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，好发于50岁以上人群，但近年来有逐渐年轻化的趋势，男女性发病比例约为2∶1[3]。由于胃癌早期症状不明显，易被忽视，当患者被确诊时已经处于中晚期，错过了最佳的治疗时期，故大部分胃癌患者预后不良，复发转移率较高[13]。有研究结果显示，miRNA主要参与了肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭、迁移等过程，其异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关[14]。有研究发现，miR-181、miR-145等参与了胃癌的发生、发展，可作为胃癌的生物标志物[15-16]。

本研究结果显示，胃癌组化疗前血清miR-21相对表达量高于正常对照组（P<0.05），miR-135 a相对表达量低于正常对照组（P<0.05）；高表达miR-21和低表达miR-135a与胃癌患者淋巴结转移、中高分化、浸润程度（浆膜层）密切相关，但与年龄、性别、远处转移、TNM分期无关，说明miR-21和miR-135可能参与了胃癌的发病过程。miR-21和miR-135a与消化系统肿瘤的发生、发展密切相关。有研究发现，在消化系统肿瘤，如胃癌中，miR-21表达上调，miR-135a表达下调[9，17]。miR-21可通过抑制磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）的表达，阻碍磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB；又称Akt）信号通路，促进肿瘤细胞增殖[18]；还可通过下调程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4，Pdcd4）的表达，诱导结直肠癌细胞的侵袭和迁移[19]。miR-135a与驱动蛋白家族成员C1（kinesin family member C1，KIFC1）结合后可下调KIFCI的表达，抑制胃癌细胞增殖，促进胃癌细胞凋亡[20]。在伴有淋巴结转移的胃癌患者中，miR-135a可抑制瞬时受体电位通道1的表达，从而抑制胃癌的淋巴结转移，减缓胃癌的发展[21]。

miR-21和miR-135a与胃癌的进展密切相关。本研究结果显示，在24个月的随访期中，化疗后复发转移患者的血清miR-21相对表达量随随访时间的延长而升高（P<0.05），血清miR-135a相对表达量随随访时间的延长而降低（P<0.05）。提示miR-21和miR-135a与胃癌化疗后复发转移密切相关。本研究ROC曲线分析结果显示，随访24个月时的miR-21和miR-135a单项检测判断胃癌预后的AUC分别为0.789、0.826，敏感性和特异性均>70%，两者联合检测可在特异性稍降低（67.8%）的基础上将敏感性提高至91.2%。这说明miR-21和miR-135a联合检测判断胃癌患者化疗后2年内是否会发生复发或转移具有较好的价值。

综上所述，胃癌患者血清miR-21和miR-135a表达异常，且表达水平与胃癌患者的淋巴结转移、分化程度、浸润程度密切相关。血清miR-21和miR-135a联合检测对胃癌化疗后复发或转移的判断具有较好的价值。