HPLC 法同时测定磺胺止咳口服液中4 个成分的含量*

蔡亮亮，林 昕，倪荣华，周盈盈，王 钦，范义凤**

1 南通大学附属医院 药学部，南通 226001；2 南京中医药大学 翰林学院药学院，泰州225300

磺胺止咳口服液为南通大学附属医院的院内特色制剂，处方组成为：磺胺甲恶唑50 g、甲氧苄啶5 g、盐酸溴己新0.8 g、甘草流浸膏50 mL、其余为药用辅料，加水至1000 mL。临床主要用于治疗儿童因感冒、支气管炎、肺炎引起的咳嗽咳痰，效果显著[1]。该复方制剂的原质量标准仅检测磺胺甲恶唑、甲氧苄啶的含量，未检测盐酸溴己新、甘草流浸膏的含量。甘草酸是甘草流浸膏的主要有效成分，《中国药典》（2020 年版，一部）规定甘草流浸膏中甘草酸的含量不得少于1.8%（g·mL-1）[2]。因此，有必要检测该复方制剂中甘草酸的含量。目前已有文献报道，采用高效液相色谱法（HPLC）分别检测磺胺甲恶唑[3]、甲氧苄啶[4]、盐酸溴己新[5]、甘草酸[6]的含量；也有文献报道采用HPLC 法同时检测磺胺甲恶唑与甲氧苄啶的含量[7]；但是未见文献报道采用HPLC 法同时检测磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、盐酸溴己新、甘草酸的含量。因此，为了全面控制磺胺止咳口服液的质量，确保临床用药安全有效。本研究建立了HPLC 法同时检测磺胺止咳口服溶液中4 个成分的含量，并为磺胺止咳口服液质量标准的提高提供科学依据。

1 仪器与药品、试剂

Agilent 1200 高效液相色谱仪，Cary-300 型紫外可见分光光度计（均安捷伦科技公司）；BT25 S 型十万分之一电子分析天平（赛多利斯科学仪器公司）；FE28 型pH 计（梅特勒-托利多仪器公司）。

对照品：磺胺甲恶唑（批号：100025-201906，纯度99.8%）、甲氧苄啶（批号：100031-201606，纯度99.8%）、盐酸溴己新（批号：100427-201903，纯度99.9%）、甘草酸铵（批号：110731-202021，纯度96.2%）均购自中国食品药品检定研究院。

磺胺止咳口服液（批号：20210108、20210327、20210409）由南通大学附属医院制剂室提供。乙腈、甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Phenomenex Luna-C18（4.6mm×250mm，5 μm）；流动相A：0.2%三乙胺水溶液（用磷酸调节pH 至2.5）-乙腈（90∶10，v∶v），流动相B：乙腈（梯度洗脱：0～2 min，10%B；2～8 min，10%B→12%B；8～30 min，12%B→38%B；30～35 min，38%B→70%B；35～36 min，70%B→10%B；36～45 min，10%B）；柱温：35 ℃；检测波长：250 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。

取磺胺止咳口服液1 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，振荡混匀，离心取其上清液，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液即得系统适用性溶液。理论板数按磺胺甲恶唑计算不低于3000，磺胺止咳口服液中4 个成分与相邻杂质峰的分离度应符合要求。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 磺胺甲恶唑对照品溶液：取磺胺甲恶唑约100 mg，精密称定，置于5 mL 量瓶中，加入适量甲醇，超声溶解，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，得磺胺甲恶唑对照品储备溶液；精密量取该储备溶液2.5 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

甲氧苄啶对照品溶液：取甲氧苄啶约50 mg，精密称定，置于10 mL 量瓶中，加入适量甲醇，超声溶解，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，得甲氧苄啶对照品储备溶液；精密量取该储备溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

盐酸溴己新对照品溶液：取盐酸溴己新约16mg，精密称定，置于20 mL 量瓶中，加入适量甲醇，超声溶解，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，得盐酸溴己新对照品储备溶液；精密量取该储备溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

甘草酸对照品溶液：取甘草酸铵约16mg（甘草酸质量=甘草酸铵质量×0.9797），精密称定，置于10mL量瓶中，加入适量甲醇，超声溶解，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，得甘草酸铵对照品储备溶液；精密量取该储备溶液1 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

混合对照品溶液：分别精密量取磺胺甲恶唑对照品储备溶液2.5mL、甲氧苄啶对照品储备溶液1mL、盐酸溴己新对照品储备溶液1 mL、甘草酸铵对照品储备溶液1 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密量取磺胺止咳口服液1mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，振荡混匀，离心（5000 r·min-1）20 min，取上清液，用0.45 μm 滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液 按照磺胺止咳口服液处方配比及制备工艺，制成不含磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、盐酸溴己新、甘草流浸膏的阴性样品；再按“2.2.2”项下的方法制得阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 精密吸取“2.2”项下的阴性样品溶液、磺胺甲恶唑对照品溶液、甲氧苄啶对照品溶液、盐酸溴己新对照品溶液、甘草酸对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，按“2.1”色谱条件进样检测，记录色谱图，见图1。结果甲氧苄啶、磺胺甲恶唑、盐酸溴己新、甘草酸铵出峰时间分别为4.817、17.511、25.091、31.127 min，这4 个成分与之相邻峰的分离度均＞1.5。表明磺胺止咳口服液中其它成分不干扰4 个主成分的检测，方法专属性良好。

图1 专属性试验高效液相色谱图

2.3.2 检测限、定量限确定 取“2.2.1”项下4 个成分的对照品溶液，用甲醇逐步稀释，取各溶液10 μL进样检测，计算主峰峰高与基线噪音的比值（S/N）。以比值为3 时的浓度计为检测限浓度；比值为10时的浓度计为定量限浓度。结果磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、盐酸溴己新、甘草酸的检测限浓度分别为0.032、0.022、0.033、0.101 μg·mL-1；定量限浓度分别为0.095、0.065、0.098、0.404 μg·mL-1。

2.3.3 线性关系考察 以磺胺止咳口服液中4 个成分在供试品溶液中的浓度为100%，考察4 个成分在50%～150%浓度范围内的线性关系。精密量取甲氧苄啶、盐酸溴己新、甘草酸对照品储备液0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mL，分别置于6 个10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度；另精密量取磺胺甲恶唑对照品储备溶液1.25、1.5、2、2.5、3、3.75 mL，分别置于6 个10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度。以上述各溶液10 μL 进样检测，记录色谱图。以峰面积（Y，mAU）对浓度（X，mg·mL-1）作线性回归，结果见表1。

表1 4 个成分的线性关系

2.3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，室温下分别于0、1、2、4、6、8、12、24、48 h 取样检测，记录色谱图。结果磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、盐酸溴己新、甘草酸峰面积的RSD 分别为0.45%、1.28%、1.69%、1.53%，表明供试品溶液室温放置48 h 内基本稳定。

2.3.5 进样精密度试验 取4 个成分的对照品溶液，照“2.1”项下色谱条件进样检测，连续测定6 次，记录色谱图。结果磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、盐酸溴己新、甘草酸峰面积的RSD 分别为0.84%、1.37%、1.75%、1.01%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验 取同一批次磺胺止咳口服液，照“2.2.2”项下方法分别制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测；另取混合对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积分别计算磺胺磺胺止咳口服液中4 个成分的含量。结果磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、盐酸溴己新、甘草酸的平均含量分别为49.82、5.11、0.81、1.21 mg·mL-1；RSD 分别为1.42%、1.57%、1.65%、0.52%，表明方法的重复性良好。

2.3.7 回收率试验 精密称定甲氧苄啶20、25、30 mg（处方量的80%、100%、120%），分别置于5 mL量瓶中，加入阴性样品溶液适量，超声振荡，用阴性样品溶液稀释至刻度，每个浓度平行配制3 份。同法制备磺胺甲恶唑、盐酸溴己新、甘草酸的样品溶液。样品溶液照“2.2.2”项处理，分别制得4 个成分的供试品溶液。分别精密量取4 种成分的供试品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样检测；另取混合对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积分别计算4 个成分的含量。结果磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、盐酸溴己新、甘草酸的平均回收率分别为99.57%、101.28%、98.71%、98.15%；RSD 分别为1.32%、0.98%、1.56%、1.78%（n=9）；表明方法的准确度良好。

2.3.8 耐用性试验 分别考察梯度的初始比例、检测波长、柱温、流速、流动相的pH 值、不同型号的色谱柱对本法色谱行为的影响。耐用性试验条件见表2。

表2 耐用性试验条件

结果显示，在可接受的变动条件下，这4 个成分与之相邻峰的分离度＞1.5，含量测定值均符合要求，说明色谱条件耐用性良好。

2.3.9 样品含量测定 取3 个批号磺胺止咳口服液，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。分别取供试品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录各成分峰面积。通过标准曲线方程计算磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、盐酸溴己新、甘草酸的含量，结果见表3。

表3 磺胺止咳口服液中4 个成分的含量（mg·mL-1）

3 讨论

3.1 检测波长的选择

分别取磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、盐酸溴己新、甘草酸对照品溶液适量，用甲醇稀释至约20 μg·mL-1。照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2020 年版四部通则0401），于波长200～400 nm 范围内扫描。磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、盐酸溴己新、甘草酸的最大吸收波长分别为270、288、249、247 nm。

磺胺止咳口服液按处方配比计算，含磺胺甲恶唑（50 mg·mL-1）、甲氧苄啶（5 mg·mL-1）、盐酸溴己新（0.8 mg·mL-1），甘草酸（＞0.9 mg·mL-1）。在此制剂中，磺胺甲恶唑、甲氧苄啶的浓度远大于盐酸溴己新、甘草酸的浓度，为了提高盐酸溴己新、甘草酸在此色谱条件下的检测灵敏度，本研究采用250 nm 作为此制剂的检测波长。

3.2 供试品溶液制备方法的选择

磺胺止咳口服液中4 个成分在水中溶解度差，在甲醇中溶解度较好，故选择甲醇作为溶剂。按处方配比计算，磺胺甲恶唑浓度为50 mg·mL-1，盐酸溴己新浓度仅为0.8 mg·mL-1，浓度相差较大，若直接进样，磺胺甲恶唑进样量会超过柱容量（超载）。因此考虑对样品溶液稀释处理再进样。样品溶液用甲醇稀释8 倍进样，磺胺甲恶唑超载；样品溶液稀释10 倍进样，4 个成分均可以检测到，且没有超载，峰形较好。因此，采用甲醇对样品溶液稀释10 倍，作为供试品溶液的制备方法。

3.3 色谱条件的选择

3.3.1 流动相pH 的选择 流动相的pH 对化合物的保留有重要影响，酸性化合物随pH 增大，保留时间减小；碱性化合物一般随pH 增大，保留时间增大，酸性条件下则保留弱，出峰时间短，峰形尖锐，常需要添加扫尾剂。化合物的分子与离子形式共存，峰型通常较差，本制剂的主要成分磺胺甲恶唑、盐酸溴己新、甘草酸呈酸性，甲氧苄啶呈弱碱性，因此，在选择流动相pH 时考虑将其以分子或者离子形式存在。分别考察不同流动相pH 值（2、3、4、6）对4 个化合物色谱行为的影响，经过多次尝试，最终确定流动相A 为0.2%三乙胺水溶液（用磷酸调节pH 至2.5）-乙腈（90∶10，v/v）；流动相B 为乙腈。使分离效果良好。

3.3.2 洗脱方式的选择 在流动相筛选中，选用流动相A 为0.2%三乙胺溶液（用磷酸调节pH 至2.5）-乙腈（90∶10）；流动相B 为乙腈。方法建立初应选择强流动相洗脱样品，这样可在较短的时间内使样品中强保留组分洗脱出来[8]。首先采用流动相A-流动相B（10∶90）进行洗脱，结果发现，色谱图上峰的个数少，各成分峰几乎重合，这是因为流动相体系中乙腈比例高，洗脱能力太强，故考虑降低乙腈的比例。采用流动相A-流动相B（60∶40）进行洗脱，色谱图上各峰分离度有所改善，但是分离度还未符合要求。以主成分峰与相邻杂质峰之间分离度为评价指标，在分离度合格的基础上尽量缩短洗脱时间。尝试用梯度条件（0～2 min，20%B；2～30 min，20%B→70%B；30～35 min，70%B；35～36 min，70%B →20%B；36～45 min，20%B）进行分析。甲氧苄啶与相邻杂质峰的最小分离度为1.06，不符合要求。经过多次调整，确定“2.1”的色谱条件。在此条件下，磺胺止咳口服液4个成分的峰与相邻杂质峰间的分离度均＞1.5，各峰的保留时间适宜。