鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠肠道菌群及抗氧化能力的影响

任吴疆，张静，霍清，刘彦霞，郭豫，赵建，白海燕*

（1.北京联合大学生物化学工程学院，北京 100023；2.北京联合大学应用文理学院保健食品检验中心，北京 100191）

肠道菌群是指分布在肠道的微生物菌群，它们与肠道系统共同构成了肠道微生态，是维持肠道正常功能的基本保障[1]。人体胃肠道内栖息着数量及种类繁多的微生物，这些微生物通过生物拮抗、免疫反应和调节机体代谢等方式影响人体健康[2-3]。研究发现，肠道菌群不仅能够调节肠道的动态平衡[4]，还能分解食物中的大分子多糖，参与营养物质的消化和吸收，维持肠上皮屏障的完整性[5]。肠道微生物菌群的结构、功能及其产生的生物活性代谢产物对维持人体肠道健康具有重要意义[6]。益生菌是一种能够平衡宿主肠道内菌群，并且可以产生活性物质，同时对宿主产生有益作用的微生物，是人类及动物肠道内尤为重要的生理菌[7]。乳酸菌作为广泛分布在动物肠道内的一种益生菌，具有多种益生功能，不仅能够调节机体的免疫系统，维持肠道菌群平衡，还具有一定的抗氧化能力，能够清除肠道内的活性氧分子，保持肠道微生物生态系统的稳定[8]。

鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus，LGG）多存在于人和动物的肠道内，属于乳杆菌属，鼠李糖亚种，是厌氧、耐酸、不产芽孢的一种革兰氏阳性益生菌，具有耐胆汁盐、耐多种抗生素等生物学特点[9]，其对肠道内环境的耐受性好、肠道黏着率高、定植能力强，有助于提高机体非特异性免疫，增强机体抵抗肠道致病菌感染的能力[10]。鼠李糖乳杆菌R9639（Lactobacillus rhamnosus R9639）是从自然发酵酸马奶中分离得到的1株益生菌，具有胃肠消化液良好的耐受性，能够以活的状态进入人体肠道。聂颖兰等[11]的研究发现鼠李糖乳杆菌R9639可以通过增强体液免疫、细胞免疫、单核-巨噬细胞功能和免疫细胞中的自然杀伤细胞活性来增强小鼠的免疫功能。但目前研究中鼠李糖乳杆菌R9639在肠道菌群及抗氧化能力方面的相关研究较少，有待进一步探究。

因此，本研究主要采用鼠李糖乳杆菌R9639制剂灌胃正常小鼠，探究其对正常小鼠体重和摄食、小肠形态、脏器系数、小肠和肝脏组织抗氧化水平、肠道微生物和小鼠粪便短链脂肪酸的影响，以期为阐明鼠李糖乳杆菌R9639和宿主的相互作用关系积累基础研究，并为益生菌制剂在保健食品领域应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物

44只健康SPF级BALB/c雄性小鼠[体重18 g～20 g，实验动物使用许可证号：SYXK（京）2017-0038]：北京华阜康生物科技股份有限公司。所有动物均饲养于北京联合大学应用文理学院SPF级动物房，饲养室温度为（20±2）℃、相对湿度为45%～60%。本研究动物实验设计和实施方案通过了北京联合大学伦理委员会审核和批准（实验动物伦理委员会意见书编号20210902）。

1.2 材料与试剂

鼠李糖乳杆菌 R9639（2×1011CFU/g）：北京科拓恒通生物技术股份有限公司；谷胱甘肽（gutathione，GSH）测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（gutathione peroxidase，GSH-Px）测定试剂盒、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）测定试剂盒、丙二醛（mlondialdehyde，MDA）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；白细胞介素-2（iterleukin-2，IL-2）、白细胞介素-6（iterleukin-6，IL-6）、白细胞介素-1β（inter-leukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tmor necrosis factor-α，TNF-α）试剂盒：武汉华美生物工程有限公司；伊红美蓝琼脂培养基、叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂培养基、乳杆菌选择性培养基、双歧杆菌选择性培养基、产气荚膜梭菌选择性培养基：麦克林试剂公司。

1.3 仪器与设备

Infinite M NANO TECAN酶标仪：广州深华公司；CPA225D电子分析天平：美国Sartorius公司；Centrifuge 5702 RH-低速离心机：德国Eppendorf公司；Hula Dancerbasic漩涡振荡器：德国IKA公司；Milli-QEQ7000超纯水机：法国Millipore公司；UV-4802紫外可见分光光度计：尤尼柯仪器有限公司；GI54DW高压灭菌锅：美国Zealway公司；DHG-9003电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；NU-9483E超低温冰箱：美国Nuaire公司；HHW21.420D恒温水箱：天津泰斯特仪器有限公司；Agilent 8890气相色谱仪：美国安捷伦公司。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及分组处理

取44只SPF级健康雄性BALB/c小鼠，适应性饲养7 d后，随机分为4组，每组11只，分为对照组（C）、低剂量组（L）、中剂量组（M）、高剂量组（H），其中低、中、高剂量组分别灌胃 0.25×108、0.50×108、1.50×108CFU/kg鼠李糖乳杆菌R9639制剂，对照组灌胃相同体积的生理盐水，连续灌胃30 d。实验过程中小鼠自由摄取食物和饮水。灌胃期间每天测量小鼠体重和摄食情况并记录。

1.4.2 小鼠脏器系数的测定

BALB/c小鼠灌胃结束后，将所有小鼠脱颈处死，进行解剖，取出心、肝、脾、肺、肾、胸腺等脏器进行称重并记录，计算其脏器系数。

1.4.3 小鼠小肠质量和长度的测定

BALB/c小鼠解剖后，取出并测量小肠的质量和长度，比较各组之间小鼠小肠质量和长度的变化。

1.4.4 小鼠血清中炎症细胞因子的含量测定

BALB/c小鼠脱颈处死前，摘眼球取血，离心取小鼠血清，用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定IL-2、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量，具体实验步骤严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.4.5 小鼠抗氧化能力水平的测定

BALB/c小鼠解剖后，取出小肠的空肠段和肝脏组织，对组织中的MDA、T-SOD、GSH、GSH-Px含量进行测定，详细步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.6 小鼠粪便菌群计数

在小鼠灌胃的第0天和第30天，无菌操作收集所有小鼠粪便0.1 g，加入稀释液充分振荡混匀，10倍梯度稀释至10-8，分别用相应的培养基进行培养，培养结束后计算每克湿便中肠杆菌、肠球菌、乳杆菌、双歧杆菌和产气荚膜梭菌的活菌数，均取对数计算以lg（CFU/g）表示。肠杆菌选择伊红美蓝琼脂培养基，（36±1）℃培养24 h；肠球菌选择叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂培养基，（36±1）℃培养48 h；乳杆菌选择乳杆菌选择性培养基，（36±1）℃培养48 h；双歧杆菌选择双歧杆菌选择性培养基，（36±1）℃厌氧培养48 h；产气荚膜梭菌选择产气荚膜梭菌选择性培养基，（36±1）℃厌氧培养24 h。

1.4.7 小鼠粪便的短链脂肪酸检测分析

参考Zubaidah等[12]的方法，采用气相色谱法检测乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的含量。每只小鼠取粪便约0.2 g，加入0.25 mL 25% H3PO3，在室温25℃下振荡混匀，静置1 min，加入1.25 mL丙酮，充分混匀后3 000 r/min离心5 min，取上清液0.35 mL，再加入0.65 mL丙酮，12 000 r/min离心5 min，取上清液200 μL，使用气相色谱仪进行检测。

气相色谱条件为色谱柱：DB-FFAP毛细管柱；载气：纯度为99.99%氮气；柱温：初始温度40℃，以10℃/min升至200℃，保持3 min，检测器温度为270℃。

1.5 统计学分析方法

应用SPSS 26.0统计软件进行显著性分析，采用单因素方差分析，所有数据均以均值±标准差表示。小鼠粪便细菌计数实验采用独立样本t检验，各组自身前后比较采用成对t检验。p＜0.05表示有显著差异，p＜0.01表示有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠体重和摄食的影响

鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠体重和摄食的影响见图1。

图1 鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠体重和摄食的影响Fig.1 The effect of Lactobacillus rhamnosus R9639 on body weight and food intake of mice

由图1 A可知，小鼠体重随着时间的缓慢延长，各组之间小鼠体重无显著差异（p＞0.05）；由图1 B可知，小鼠的摄食各组之间也无显著差异（p＞0.05）。上述结果表明鼠李糖乳杆菌R9639制剂对健康小鼠体重、摄食均无影响。

2.2 鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠脏器系数的影响

脏器系数又称脏体比，是实验动物某脏器的质量与其体重的比值。脏器系数可反映动物内脏的功能状态，是机体营养代谢和健康状态的综合表征，也是药物安全评价中必要的检测指标。正常时各脏器质量与体重的比值比较恒定。一般情况下，脏器系数增大，表示脏器充血、水肿或增生肥大等；脏器系数减小，表示脏器萎缩及其他退行性改变[13]。鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠脏器系数的影响见表1。

表1 鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠脏器系数的影响Table 1 The effect of Lactobacillus rhamnosus R9639 on the organ coefficient of mice

由表1可知，各剂量组与对照组心、肝、脾、肺、肾、胸腺等主要脏器相比均无显著差异（p＞0.05），上述结果说明鼠李糖乳杆菌R9639制剂对小鼠脏器系数无显著影响（p＞0.05）。

2.3 鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠小肠质量和长度的影响

小肠作为消化营养物质最重要的器官，与机体的健康密切相关[14]，小肠长度过短、质量过轻可能会造成短肠综合征，小肠长度和质量的增加不仅可以改善肠道的发育，还可以加快机体对营养物质的消化吸收[15-16]。此外，微生物群可以影响肠道形态，从而改善肠道发育、健康和功能[17]。鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠小肠质量和长度的影响见图2。

图2 鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠小肠质量和长度的影响Fig.2 Effects of Lactobacillus rhamnosus R9639 on the quality and length of small intestine in mice

由图2可知，鼠李糖乳杆菌R9639灌胃后的小肠质量和长度均无显著差异（p＞0.05），表明其对小肠质量和长度无明显影响。

2.4 鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠血清中炎症细胞因子含量的影响

研究表明，在氧化自由基过多的情况下，T细胞功能低下，不能有效控制B细胞，导致自身抗体过多产生，使机体不能准确识别自己和非己，从而导致一些严重的疾病。益生菌不仅能够调节肠道微生物群，还能调节局部或全身水平的免疫。益生菌的抗炎作用是通过免疫调节和炎症细胞因子调节来实现的[18]。Wong等[19]的研究发现益生菌、益生元有抗炎作用，可以通过调节肠道微生物群来加强肠道屏障、抑制IL-6/STAT3信号传导。本研究对小鼠血清中炎症因子含量的影响见图3。

图3 小鼠血清中炎症细胞因子的含量Fig.3 The content of inflammatory cytokines in serum of mice

由图3可知，本实验灌胃鼠李糖乳杆菌R9639制剂后，低剂量组与对照组相比，IL-1β水平极显著降低（p＜0.01），IL-6水平显著降低（p＜0.05）；中剂量组与对照组相比，IL-6、IL-1β 水平极显著降低（p＜0.01）；高剂量组与对照组相比，IL-2、IL-6、IL-1β水平极显著降低（p＜0.01），TNF-α水平显著降低（p＜0.05）。上述结果表明，在鼠李糖乳杆菌R9639制剂灌胃后，IL-2、IL-6、IL-1β、TNF-α细胞因子水平均有所降低，说明鼠李糖乳杆菌R9639制剂对炎症细胞因子水平具有一定的调节作用，有助于维持肠道微生物群的生态平衡，从而避免了因肠道生态失衡可能引起的肠道屏障完整性被破坏而导致局部或全身炎症。

2.5 鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠组织抗氧化水平的影响

抗氧化是抗氧化自由基的简称，人体由于外界污染、放射线照射以及自身新陈代谢等活动会不断产生氧化自由基。作为抗氧化系统中重要的酶，SOD和CAT的活性高低可以表示机体清除自由基能力的强弱，体内脂质过氧化的程度可以用MDA水平反映[20]。以往研究结果显示，摄入乳酸菌有助于提高抗氧化能力，且不同菌株之间的抗氧化能力不尽相同[21]。Qian等[22]的研究发现植物乳杆菌CQPC11可以提高衰老小鼠血清、肝脏和脾脏组织中SOD、GSH-Px和GSH的水平，降低MDA的水平。Zhang等[23]的研究发现发酵乳杆菌JX306能显著降低血清、肾脏和肝脏组织中MDA的水平，提高GSH-Px的水平和总抗氧能力。本研究对小鼠组织抗氧化水平的影响见表2。

表2 鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠组织抗氧化水平的影响Table 2 The effect of Lactobacillus rhamnosus R9639 on antioxidant level in mice tissues

由表2可知，小肠组织中，低剂量组与对照组相比，MDA的水平显著降低（p＜0.05）；中剂量组与对照组相比，T-SOD和GSH的水平显著升高（p＜0.05），GSH-Px的水平极显著升高（p＜0.01），MDA的水平极显著降低（p＜0.01）；高剂量组与对照组相比，T-SOD、GSH和GSH-Px水平均极显著升高（p＜0.01），MDA水平极显著降低（p＜0.01）。肝脏组织中，低剂量组与对照组相比，GSH和GSH-Px水平显著升高（p＜0.05）；中剂量组与对照组相比，T-SOD、GSH和GSH-Px水平均极显著升高（p＜0.01）；高剂量组与对照组相比，T-SOD、GSH和GSH-Px水平均极显著升高（p＜0.01），MDA水平显著降低（p＜0.05）。结果表明，各剂量组指标与正常小鼠相比，对T-SOD、GSH和GSH-Px水平均有不同程度提高，并降低了MDA的水平，表现出了剂量依赖性，说明鼠李糖乳杆菌R9639制剂有助于改善、提高小鼠小肠和肝脏组织的抗氧化水平，增强小鼠小肠和肝脏组织的抗氧化防御系统能力，从而维持了小鼠肠道内微生物的生态平衡。

2.6 鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠肠道常见微生物的影响

对灌胃鼠李糖乳杆菌R9639制剂前后的小鼠粪便中肠杆菌、肠球菌、乳杆菌、双歧杆菌和产气荚膜梭菌进行计数，结果见图4。

图4 鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠肠道微生物的影响Fig.4 Effects of Lactobacillus rhamnosus R9639 on the intestinal microbes of mice

由图4可知，灌胃前第0天，肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌、乳杆菌和双歧杆菌各组数量与第30天对照组或第0天自身比较均无显著差异（p＞0.05），灌胃后第30天，低剂量组各菌含量与第30天对照组或第0天自身比较均无显著差异（p＞0.05），中剂量组和高剂量组乳杆菌和双歧杆菌含量均有所增加，其中中剂量组乳杆菌和双歧杆菌与第30天对照组相比均有显著差异（p＜0.05），与第0天自身相比，分别有显著差异（p＜0.05）和极显著差异（p＜0.01）。高剂量组乳杆菌和双歧杆菌与第30天对照组及第0天自身相比均有极显著差异（p＜0.01）。结果表明，灌胃中、高剂量鼠李糖乳杆菌R9639制剂乳杆菌和双歧杆菌数量显著增加，有助于调节和改善小鼠肠道菌群，促进小鼠肠道的健康。

2.7 鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠粪便中短链脂肪酸的影响

短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）也称挥发性脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、异丁酸，SCFAs对于维持大肠的正常功能和结肠上皮细胞的形态和功能具有重要作用，也可促进钠的吸收，丁酸在这方面的作用比乙酸和丙酸更强，并且丁酸可以增加乳酸杆菌的数量和减少大肠杆菌的数量。目前研究表明，SCFAs主要由肠道内未消化的碳水化合物经厌氧菌酵解产生，结肠厌氧菌发酵产生乙酸、拟杆菌门发酵产生丙酸、厚壁菌门发酵代谢产生丁酸[24]，这些菌属及其产生的SCFAs对肠屏障功能的维护有重要作用[25]。鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠粪便中短链脂肪酸的影响见图5。

图5 鼠李糖乳杆菌R9639对小鼠粪便短链脂肪酸的影响Fig.5 Effects of Lactobacillus rhamnosus R9639 on SCFAs in feces of mice

由图5可知，各剂量组与对照组相比，中、高剂量组乙酸、丙酸、丁酸含量均极显著升高（p＜0.01），低剂量组丙酸和丁酸含量与对照组相比极显著升高（p＜0.01）、乙酸含量与对照组相比显著升高（p＜0.05），异戊酸和异丁酸各剂量组之间无显著差异（p＞0.05）。结果表明，在鼠李糖乳杆菌R9639制剂灌胃后，粪便SCFAs的检测多为乙酸、丙酸和丁酸，这些SCFAs都能在短时间内被结肠吸收，鼠李糖乳杆菌R9639制剂的干预对肠道中SCFAs含量的影响存在一定的量效关系。

3 结论

本研究主要探究了鼠李糖乳杆菌R9639制剂对健康小鼠小肠和肝脏组织抗氧化水平、血清中炎症细胞因子含量、肠道微生物和粪便中短链脂肪酸的影响。结果表明鼠李糖乳杆菌R9639可以有效降低血清中IL-2、IL-6、IL-1β、TNF-α炎症细胞因子水平，提高小肠和肝脏组织中T-SOD、GSH和GSH-Px的水平、降低MDA的水平，提高组织的抗氧化水平和机体的免疫水平、增加肠道内的有益菌、减少有害菌，提高了肠道中短链脂肪酸乙酸、丙酸和丁酸的含量。鼠李糖乳杆菌R9639制剂可以通过调节机体内抗氧化酶的活性、炎症细胞因子的水平来维持肠道内微生物的生态平衡，对促进小鼠的健康有一定效果。