HPLC法测定复方绞股蓝袋泡茶中槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量

李燕思，刘 梅，许桂丽，尹琼玉，鲁 毅

（东部战区空军医院药学部,江苏 南京 210002）

复方绞股蓝袋泡茶为东部战区空军医院院内制剂［制字（2016）F516004］，由绞股蓝、决明子、三七花三种中药材组成，处方中三种药材比例为3∶5∶2。该制剂具有清热平肝、化瘀祛湿的功效，可用于高血脂、高血压的辅助治疗。方中绞股蓝为葫芦科植物绞股蓝Gynostemma pentaphyllumMakino 的干燥地上部分，具有清热解毒、止咳祛痰、生津安神等作用，广泛应用于心脑血管、肿瘤等疾病的治疗［1-2］。研究表明，绞股蓝中含有多种皂苷、黄酮、多糖等化学成分，目前对其有效成分的研究多集中在皂苷成分，而对另一类活性成分黄酮关注较少［3-4］。研究表明，黄酮类化合物具有显著的生理活性，如抗氧化、清除氧自由基、改善心脑血管循环和调节血压等［5-6］。基于此，本试验采用HPLC 法测定复方绞股蓝袋泡茶中黄酮类成分槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量，为全面有效控制该制剂的质量提供参考和依据。

1 实验材料

1.1仪器 SPD10A 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；FA-2004N 电子天平（上海精科实业有限公司）；CPA225D电子天平（德国赛多利斯股份公司）。

1.2试药 槲皮素（批号：100081-200406）、山柰素（批号：110861-201611）、异鼠李素对照品（批号：110860-200608），均购自中国药品生物制品研究所；复方绞股蓝袋泡茶（每袋3.0 g，本院制剂室自制）；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方 法

2.1色谱条件 色谱柱：InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5µm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）；流速：1.0 ml/min；检测波长：360 nm；进样量：10 µl。理论塔板数按槲皮素、山柰素、异鼠李素峰计算应不低于5 000。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 取槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇制成槲皮素、山柰素、异鼠李素浓度分别为28.3 µg/ml、31.6 µg/ml、22.4 µg/ml 的混合溶液，微孔滤膜（0.45 µm）滤过，取续滤液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备 取本品装量差异项下的内容物，混合均匀，研细，精密称定3.0 g，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇20 ml、25%盐酸溶液5 ml，摇匀，置水浴中加热回流30 min，迅速冷却至室温，转移至50 ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45µm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液的制备 按处方比例制备缺绞股蓝药材的阴性制剂，按“2.2.2”供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

2.3专属性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10µl，按以上色谱条件进样分析，结果待测的三种成分与相邻色谱峰的分离度均＞2，能达到较佳的分离效果，且阴性对照溶液对测定无干扰。对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液色谱图见图1。

图1 对照品（A）、供试品（B）、阴性对照（C）HPLC色谱图

2.4线性关系考察 分别取槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇制成含槲皮素、山柰素、异鼠李素分别为71.26 µg/ml、79.37 µg/ml、48.40 µg/ml 的混合对照品贮备液。精密吸取上述混合对照品贮备液各1 ml、2 ml、4 ml、6 ml、8 ml，置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度。精密称取系列溶液各10µl，按“2.1”项下方法进样检测，测定峰面积。以峰面积为纵坐标Y，以对照品进样量（µg）为横坐标X，绘制标准曲线。槲皮素、山柰素、异鼠李素的回归方程分别为：Y=4.2×106X-37 975（r=0.999 8）、Y=4.3×106X-68 611（r=0.999 5）、Y=4.1×106X-19 226（r=0.999 7），结果表明槲皮素在0.071～0.570µg、山柰素在0.079～0.635 µg、异鼠李素在0.048～0.387 µg 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5精密度试验 精密吸取“2.2.1”项混合对照品溶液10µl，按“2.1”项下方法检测，连续进样6次，测出槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的RSD 分别为1.26%、1.08%、1.31%（均n=6），结果表明精密度良好。

2.6稳定性试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（批号为170213），分别于0 h、8 h、16 h、24 h、48 h进样10µl，按上述条件测定峰面积，结果槲皮素、山柰素、异鼠李素RSD 分别为1.72%、1.06%、0.98%（均n=6），表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.7重复性试验 精密称取同一供试品（批号为170213），按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下方法依次测定，计算得出槲皮素、山柰素、异鼠李素含量，RSD 分别为1.54%、1.16%、1.63%（均n=6），结果表明重复性良好。

2.8加样回收率试验 精密称取已知含量的样品（批号为170213）1.5 g，精密加入一定浓度的槲皮素、山柰素、异鼠李素混合对照品溶液各1 ml，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下方法检测，计算样品含量，并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果 （n=5）

2.9样品含量测定 取3 批复方绞股蓝袋泡茶样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算得槲皮素、山柰素、异鼠李素含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果 （n=3，mg/g）

3 讨 论

3.1定量物质的选择 绞股蓝是复方绞股蓝袋泡茶的主要药物，其黄酮成分含量为2%～5%［4］。黄酮作为植物体内次生代谢产物之一，其主要功能为调节植物生长素的运输，且具有多种生物活性［5-7］。本研究选择以绞股蓝中黄酮类成分槲皮素、山柰素、异鼠李素为定量成分，能对复方绞股蓝袋泡茶的质量进行有效控制。

3.2供试品提取方法的选择 参考相关文献［8］及《中华人民共和国药典》中槲皮素等黄酮醇苷的提取方法［9］，选择以甲醇∶盐酸（体积比4∶1）为溶剂，盐酸浓度分别设为15%、25%、35%，采用加热回流提取供试品。结果显示，提取率随盐酸浓度增高而增高，但盐酸浓度不宜过高，否则将对高效液相进样阀和色谱柱有腐蚀，最终采用甲醇∶25%盐酸（体积比4∶1）为溶剂对供试品进行提取。

3.3流动相的选择 参考文献［10］中流动相的选择，槲皮素、山柰素、异鼠李素与其他成分分离效果不佳。后根据待测成分的特点，并参考文献［11-12］，适当提高磷酸水溶液比例，选用甲醇-0.4%磷酸（50∶50）作为流动相，待测的三种成分与相邻色谱峰的分离度均＞2，能达到较佳的分离效果。

本实验采用HPLC 法测定复方绞股蓝袋泡茶中槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量，方法简单、准确、重现性好，可用于复方绞股蓝袋泡茶的含量测定和质量控制。