犊牛大肠杆菌和沙门氏菌佐剂灭活疫苗的制备与临床效果观察

吴中艳，覃 杰

（1.新疆生产建设兵团第二师37团农发中心，新疆 且末 841900；2.新疆生产建设兵团第二师畜牧兽医站，新疆 铁门关 841005）

犊牛大肠杆菌病是由大肠杆菌引起的以犊牛腹泻和败血症为主要症状的一种细菌性疾病[1]。沙门氏菌病，又名副伤寒，临床多表现为败血症和肠炎，也可使怀孕母畜发生流产。目前主要采用抗生素对其进行防治。然而抗生素的大量使用会出现耐药性和药物残留问题。大肠杆菌、沙门氏菌血清型众多不同地区血清型差异较大。本试验系从腹泻牛中分离鉴定出当地的优势血清型，制备成二联四价氢氧化铝佐剂灭活疫苗，经临床试验，此疫苗免疫原性和安全性良好。

1 材料

1.1 病料

分离鉴定出O78和O111血清型大肠杆菌、都柏林沙门氏菌以及鼠伤寒沙门氏菌。

1.2 主要试剂

营养琼脂、麦康凯琼脂、LB肉汤，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 实验动物

昆明系小白鼠来自石河子大学实验动物中心，试验牛来自铁门关市30团和31团牛场。

2 方法

2.1 大肠杆菌、沙门氏菌悬液的制备与灭活

将4种菌株分别接种于营养琼脂培养基上，挑取培养物接种于LB肉汤培养，制取种子液[2-3]。将种子液增菌并稀释细菌浓度至1014个／mL。将4种菌液按照1∶1∶1∶1比例等体积混合，向菌液中加入终浓度为0.2%的甲醛溶液，灭活24 h。将菌液接种于营养琼脂和麦康凯培养基，检测细菌活力。将收集到的灭活菌液以12 000r/min的离心速度离心5 min，弃去上清液。在超净工作台上将菌体用少量生理盐水稀释搅拌后倒入80目铜筛过滤到小瓶内，加入生理盐水，配制成含菌量为3×1010个／mL的菌液。

2.2 灭活疫苗的制备

用硫酸铝和氢氧化钠，配制成氢氧化铝佐剂原液，按1∶4的比例与生理盐水混合，配制成佐剂。按菌液量的1/3加入佐剂，充分混合，制成二联四价灭活疫苗。成年牛注射剂量为6 mL每头份，犊牛用量减半。

2.3 灭活疫苗的质量检验

无菌检验。将灭活疫苗0.2 mL分别接种于营养琼脂和麦康凯琼脂平板上，37℃培养48 h，观察有无细菌生长。

安全性试验。取10只昆明系小白鼠（公母各半）分别于颈部皮下注射灭活疫苗0.1 mL，观察采食和精神状况，以及注射部位情况和死亡情况。选取15日龄、60日龄、200日龄和2岁健康牛各10头，分别于颈部皮下注射疫苗6 mL（2岁牛12 mL），连续15 d观察试验牛的注射部位情况和精神、采食以及发病状况。

2.4 疫苗效力检验

选取20只成年小白鼠随机分成2组，试验组10只 （首免后14 d加强免疫1次）皮下注射疫苗0.1 mL/只，对照组注射生理盐水，42 d后给试验组和对照组用分离培养的O78和O111血清型大肠杆菌、都柏林沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌混合菌液0.5 mL于皮下注射攻毒，7 d后观察小白鼠的采食、精神、存活和死亡状况，如出现死亡，则对其进行细菌分离培养鉴定。

2.5 灭活疫苗免疫效果观察和攻毒试验

分组并采用皮下注射方法。A组15头（1日龄首免，14日龄加强免疫1次），B组15头 （1日龄首免，21日龄加强免疫1次）,C组15头 （60日龄首免，81日龄加强免疫1次），D组为对照组20头 （1日龄牛、60日龄牛各10头，注射生理盐水）。

血清抗体效价检测。抗原制备。浓度为30亿/mL的O78大肠杆菌、O111大肠杆菌、都柏林沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌菌液50 mL，经高压灭菌破坏其菌毛抗原后作为抗原诊断液。采用玻片凝集试验方法，取100μL血清用生理盐水从1∶2开始做倍比稀释直到1∶256，然后取稀释血清50μL与50μL抗原等体积混合，搅拌均匀，观察其凝集现象。攻毒保护试验。将浓度为30亿／mL的O78大肠杆菌、O111大肠杆菌、都柏林沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等体积混合，取6 mL分别在首免42 d后给A、B、C、D组试验牛皮下注射，连续20 d观察试验牛的采食、精神及发病状况。对出现临床症状的牛使用头孢哌酮、头孢噻呋钠或氧氟沙星进行治疗。

3 结果与分析

3.1 灭活疫苗的质量检验

无菌检查结果。经甲醛灭活后的4种细菌混合悬液在营养琼脂、麦康凯琼脂平板上培养均无菌落生长，说明灭活效果良好。将疫苗接种于营养琼脂、麦康凯琼脂平板上均无菌落生长，说明灭活效果良好。

安全性试验结果。小白鼠经注射疫苗后，除2只出现一过性精神萎靡和食欲下降外，其他小白鼠均未见不良反应。所有试验牛的注射部位未见红肿、化脓等异常现象，采食及精神状况正常，表明疫苗具有较高的安全性。

3.2 疫苗效力检验结果

试验组小白鼠精神、食欲正常，无死亡。对照组所有的小白鼠无精神萎靡和食欲不振症状，死亡8只，死亡率为80%。

3.3 灭活疫苗的免疫保护效果

由表1可知，首免7 d后免疫组 （A，B，C组）的O78血清型大肠杆菌血清凝集抗体水平为1∶2～1∶32，首免后14 d的抗体合格率为40%～60%，首免后21 d的抗体合格率为66.6%～80%。二次免疫后抗体效价提高，首免后42 d的抗体水平达到最高峰，抗体合格率为100%。免疫后180 d的抗体合格率为86.6%～100%。而对照组血清抗体水平始终处于1∶2以下。免疫组（A、B、C组）抗体效价无明显差异。

表1 O78血清型大肠杆菌凝集抗体水平测定结果

由表2可知，首免 7 d 后，免疫组（A、B、C 组）的O111 大肠杆菌血清凝集抗体水平为 1∶2～1∶32， 首免14 d后的抗体合格率为33.3%～46.6%，首免后21 d的抗体合格率为53.3%～73.3%。二次免疫后抗体效价提高，首免后42 d的抗体水平达到最高峰，抗体合格率为100%。首免后180 d的抗体合格率为86.6%～100%。而对照组血清的抗体水平始终处于1∶2以下。免疫组之间抗体效价无明显差异。

表2 O111大肠杆菌凝集抗体水平测定结果

由表3可知，首免7 d后免疫组（A、B、C组）的都柏林沙门氏菌血清凝集抗体水平为1∶2～1∶32，首免14 d后的抗体合格率为33.3%～53.3%，首免后21 d的抗体合格率为53.3%～80%。二次免疫后抗体效价提高，首免后42 d的抗体水平达到最高峰，抗体合格率为93.3%～100%。首免后180 d的抗体合格率为80.0%～100%。而对照组血清抗体水平始终处于1∶2以下。免疫组抗体效价无明显差异。

表3 都柏林沙门氏菌凝集抗体水平测定结果

由表4可知，首免后7 d免疫组（A、B、C组）的鼠伤寒沙门氏菌血清凝集抗体水平为 1∶2～1∶32，首免后14 d的抗体合格率为40.0%～66.6%，首免后21 d的抗体合格率为60%～80%。二次免疫后的抗体效价提高，首免后42 d的抗体水平达到最高峰，抗体合格率为93.3%～100%。首免后180 d的抗体合格率为80.0%～93.3%。而对照组的血清抗体水平始终处于1∶2以下。免疫组抗体效价无明显差异。

表4 鼠伤寒沙门氏菌凝集抗体水平测定结果

3.4 攻毒保护试验

免疫组牛的采食和精神状况良好，存活率达到100%。对照组牛从攻毒后第2天起陆续发病，表现为精神沉郁、无食欲、腹泻，从其粪便中分离到相关细菌。使用头孢哌酮+氧氟沙星治疗后痊愈。

4 讨论

大肠杆菌和沙门氏菌的血清型众多，且有明显的地域差异，使用本地区血清型菌株制备自家灭活疫苗，是预防本病的有效途径[2，4]。本研究结果表明，以氢氧化铝为佐剂的灭活疫苗具有较高的安全性，且经皮下注射后能被机体很好地吸收。本研究制备的灭活疫苗具有良好的免疫效果，免疫42 d后，93.3%以上免疫牛的抗体效价达到1∶32以上；免疫180 d后，80.0%以上免疫牛的抗体水平仍保持在1∶32以上。以90亿的致病菌攻毒，免疫牛全部存活，而且无不良反应，表明该疫苗的免疫保护性良好。