罗汉果甜苷对高脂饮食小鼠皮下脂肪沉积的影响

2022-07-13王司原崔可欣杨小淦梁兴伟

当代畜禽养殖业 2022年3期

王司原，崔可欣，杨小淦，梁兴伟

（广西大学动物科学技术学院亚热带生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁 530004）

脂肪沉积对畜牧生产的影响十分明显，皮下脂肪沉积与瘦肉率直接相关[1]，同时，脂肪沉积对畜禽的繁殖性能也有影响[2]。家畜脂肪沉积过度可引起饲料转化率和经济效益降低，并造成环境污染。然而，当今脂肪沉积调节途径及机制并未被全面阐述，仍然是困扰畜牧生产的主要问题。因此，寻求有效的脂肪沉积调节途径有望提高畜禽生产性能，迎合消费者需求。

影响脂肪沉积的因素是多方面的，如营养因素、遗传因素、饲养环境等。日粮的能量水平、饲料配方、饲料添加剂的合理使用及限饲手段可以调节脂肪沉积。此外，家畜机体过氧化物酶体增殖物激活受体、脂肪酸结合蛋白基因、解耦联蛋白、脂蛋白脂酶基因及激素敏感脂酶基因的表达也会影响脂肪沉积[3]。同时，饲养环境管控也是影响脂肪沉积的因素之一，温度、湿度及光照条件等对家畜的脂肪沉积会产生影响[4]。归根结底，家畜脂肪沉积源于脂肪代谢、脂肪分解的平衡，脂肪能量代谢活性降低会导致脂质过度积累，造成脂肪沉积。不法分子为追求利益，使用瘦肉精干预脂肪代谢，从而提高瘦肉产量，对消费者的生命安全造成威胁。因此，寻找安全便捷的脂肪沉积调节途径尤为重要。

罗汉果是广西地区的特色经济作物，食药功能兼备，是我国的优质中药材，也是当今市场上颇受欢迎的绿色食品添加剂。罗汉果甜苷是其主要活性成分，甜度高、热量低，生理功能丰富多样，包括但不限于降血压、降血糖、消炎抗氧化、调节机体代谢、有益于生殖等[5-8]。越来越多的报道显示，罗汉果甜苷具有调节脂肪沉积的潜力[9-10]，然而其实现作用的途径及机制并未被充分报道。

本试验旨在对罗汉果甜苷调节脂肪沉积的作用途径进行初步探索，利用模型动物构建脂肪沉积模型，探究罗汉果甜苷发挥作用的可能途径，为罗汉果甜苷在改善肉质品质中的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物及处理方法

选取24只4周龄、雄性健康、体重为15±0.5 g的C57BL/6小鼠作为实验动物。按饲养标准，在光照周期为12 h、室内温度为22±2℃、湿度为50%～60%的IVC环境内饲养，自由采食和饮水，进行为期1周的环境适应。于小鼠5周龄时开始试验，每天上午9∶00对各组小鼠进行给药处理，对照组和高脂饮食组每天灌胃等剂量的(5μL/g)蒸馏水，罗汉果甜苷处理组每天灌胃600 mg/kg的罗汉果甜苷，所选浓度由预试验得出。试验期间每周记录采食量并称取体重，调整给药量，连续处理17周。

1.2 主要试剂

维持鼠粮及高脂日粮均购自Research Diets公司；罗汉果甜苷提取物购自桂林莱茵生物科技股份有限公司（产品型号：罗汉果甜苷V 50%-MOV04，生产批号：MOV04-18022504）；苏木精伊红染液购自北京索莱宝公司。

1.3 小鼠身体组成分析

将活体小鼠置于小动物身体成分分析仪中进行无创活体检测。检测前使用菜籽油进行仪器校准，校准结束后对每只小鼠称重。称重后将小鼠放入机器配套的测定管，在不伤害小鼠的前提下固定，使得小鼠无法轻易活动。输入小鼠体重数据后，将测定管放入机器开始测量，获得脂肪含量数据、瘦肉率后将小鼠放回原饲养笼。

1.4 脂肪样本收集及形态观察

试验结束后，对小鼠进行二氧化碳麻醉，收集小鼠的血液、皮下脂肪组织并置于准备好的10%福尔马林固定液中，剩下的样本放在-196℃的液氮中，冻存于-80℃冰箱中备用。苏木精伊红（hematoxylin and eosin,H&E）染色按照标准流程执行。

1.5 皮下脂肪转录组分析

测序文库由北京百迈客公司制备，原始下机数据借助广西大学多功能并行运算平台完成分析。首先，原始数据经去接头、去冗余等质控步骤，保留碱基质量 Q＞30的纯净序列（clean reads），采用 STAR 软件对比到小鼠参考基因组（GRC_m39,Mus musculus），平均对比率达到95%以上。之后利用Feature_counts软件进行reads计数，得到的表达量信息采用DESeq2软件进行基因表达差异分析。提取P＜0.01的基因进行GO及KEGG富集。

1.6 血清LC-MS/MS检测

取冷冻的血清样本100μL，并添加3倍体积的甲醇，充分振荡均匀后进行离心处理，转移上清液并用氮气吹干，添加50μL甲醇复溶，离心后取上清液上机检测。利用 HPLC-MS系统（Thermo Fisher Scientific,USA），采用非靶向代谢组学方法进行分析。色谱柱采用Accucore C18柱（2.6μm,50 mm×2.1 mm,Thermo Fisher Scientific,USA）。流动相由含有0.025%甲酸的水和甲醇组成，流速为50μL/min。水/甲醇的梯度程序如下：0 min，60%B；2min，60%B；9 min，100%B；17 min，100%B；18 min，60%B。流动相流程完毕进行洗涤和重新平衡，总运行时长为25 min。质谱模式下的进样量为2μL，分别在正离子和负离子模式下扫描。电离参数如下：喷雾电压为4.2 kV；鞘层气体（氮气）为15个任意单位（arb）；辅助气体和扫气（氮气）为1 arb；毛细管电压为37 V；毛细管温度为275℃；管镜为80 V。扫描范围设置为50～1 200 m/z。下机数据在Compound discoverer 3.1软件分析（Thermo Fisher Scientific），使用 mzCloud（ddMS2）和ChemSpider进行物质识别定性处理。

1.7 统计学分析

所有数据采用GraphPad Prism 8.0进行分析。两组间的统计学差异采用t检验，超过两组的统计学差异采用方差分析（ANOVA），P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 罗汉果甜苷对高脂饮食小鼠身体成分的影响

如图1A所示，与对照组相比，高脂饮食造成小鼠卡路里摄入量增加，而罗汉果甜苷处理组与高脂饮食组的卡路里摄入量无显著差异。各组小鼠初始体重无显著差异，试验处理结束后，与对照组相比，高脂饮食显著增加了小鼠体重（图1B）、体脂率（图1C），显著降低了肌肉率（图1D）。然而补充罗汉果甜苷均能显著缓解上述指标变化。

图1 罗汉果甜苷对高脂饮食小鼠身体成分的影响

2.2 罗汉果甜苷对高脂饮食小鼠皮下脂肪沉积的影响

为探究罗汉果甜苷对高脂饮食小鼠皮下脂肪沉积的影响，我们首先对各组小鼠皮下脂肪重量进行称重（如图2A所示）。与对照组相比，高脂饮食导致小鼠皮下脂肪重量显著升高，而经罗汉果甜苷处理，小鼠皮下脂肪重量得到显著恢复。随后我们对各组小鼠皮下脂肪组织形态进行H&E染色观察（如图2B显示）。同比对照组，高脂饮食造成小鼠皮下脂肪细胞膨大，同时，脂肪细胞直径增加（图2C-D）。以上现象经罗汉果甜苷处理得到显著改善。

图2 罗汉果甜苷对高脂饮食小鼠皮下脂肪沉积的影响

2.3 罗汉果甜苷对高脂饮食小鼠皮下脂肪基因表达的影响

转录组测序结果展示各组小鼠皮下脂肪基因表达的情况（如图3A所示）。主成分分析显示，各组小鼠皮下脂肪基因表达的聚类模式不尽相同（图3B），通过对差异表达基因（DEG）的筛选，同对照组相比，高脂饮食引起1 560个基因表达情况发生显著改变，经罗汉果甜苷处理，681个基因的表达显著恢复。对恢复表达的基因进行GO分析，发现这些基因主要富集到脂肪酸代谢通路，包括脂肪酸的β氧化、脂肪酸的生物合成及脂质代谢等通路。KEGG分析结果显示，恢复的基因主要富集到ppar信号通路及代谢通路等。提示经罗汉果甜苷处理可能对脂肪酸代谢通路起调控作用。

图3 罗汉果甜苷对高脂饮食小鼠皮下脂肪基因表达的影响

2.4 罗汉果甜苷对高脂饮食小鼠血清代谢的影响

为进一步验证罗汉果甜苷对高脂饮食小鼠脂肪沉积的影响，本试验采用LC-MS/MS对各组小鼠血清代谢产物进行了非靶向代谢分析。经定性，笔者发现罗汉果甜苷处理能够恢复三羧酸循环相关分子及脂肪酸类分子的改变，脂肪酸类代谢分子占据较大比重。同时还发现，罗汉果甜苷处理能够显著减轻高脂饮食引起的血清尿酸、花生四烯酸含量的增加，证明罗汉果甜苷具有调节血清代谢的作用。

3 讨论

脂肪沉积对畜牧生产的影响显著，皮下脂肪沉积是影响瘦肉率最主要的因素。采取安全有效的脂肪沉积调节途径能够有效提高肉品质，提高畜牧生产效益。事实表明，罗汉果甜苷具有调节机体脂肪沉积的作用[11]，然而其实现途径及机制并未被完全报道。有研究指出，罗汉果甜苷可以激活肝脏AMPK通路，促进肝脏能量代谢以减轻肝脏脂肪沉积[7,12-13]。此外，罗汉果甜苷处理能够改善小鼠胰岛素敏感性及糖耐量受损，从而减轻高脂饮食造成的小鼠体重增加[14-15]。然而，关于罗汉果甜苷对脂肪沉积的影响途径尚未见报道。

本试验结果显示，高脂饮食造成小鼠体重、体脂的显著提升，瘦肉率显著下降，同时高脂饮食造成小鼠皮下脂肪含量显著增加，脂肪形态改变。但是经罗汉果甜苷处理，上述情况均得到显著改善。另一方面，高脂饮食造成小鼠皮下脂肪组织基因表达情况改变，部分与脂代谢、脂肪酸合成相关的基因表达改变可经罗汉果甜苷处理恢复正常。此外，罗汉果甜苷可以调节血清代谢，恢复包括尿酸、花生四烯酸等代谢产物的变化。上述结果显示，罗汉果甜苷对小鼠脂肪沉积具有明显的调节作用，然而对其深入的作用机制需要验证。