二甲双胍治疗桥本甲状腺炎作用机制的初步探讨

陈光敏，周厚地，蒋 鹏，王 娟，陈其谋

桥本甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis，HT)是一种慢性自身免疫性甲状腺疾病，其特征是自身免疫介导的甲状腺破坏[1]。由于遗传易感性、炎症、过量碘摄入、感染及其他环境因素影响，其发病率正逐渐上升[2]。目前，HT的治疗方法主要包括替代疗法和免疫疗法(如甲状腺激素、糖皮质激素等)，但大多数病人仍常常进展为亚临床及临床甲状腺功能减退，需终身随访及补充甲状腺激素，耗费大量财力及医疗资源[3]。二甲双胍作为治疗2型糖尿病的有效药物之一，其降糖外的其他作用逐渐被发现，如降低糖尿病患者心血管疾病风险、治疗神经退行性病变、抗自身免疫、抗肿瘤、抗甲状腺肿大及减少亚临床甲减发生等[4]。此外，二甲双胍可显著抑制正常甲状腺细胞和乳头状甲状腺癌细胞中TNF-α诱导的CXCL8的分泌，并呈现剂量依赖性[5]。而HT所涉及重要发病机制就有TNF-α的活性增强，然而二甲双胍作用HT的机制尚不清楚。该研究旨在初步探讨二甲双胍治疗HT的作用机制，以期为HT的治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物实验选取SPF级SD雌性大鼠45只，体质量(250±20)g，由重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(渝)2018-0003。大鼠在实验前适应性饲养1周，饲养温度22～23 ℃，相对湿度60%，光照/黑暗周期为12 h/12 h，自由饮水，给予标准饲料饲养。

1.2 主要试剂与仪器二甲双胍(纯度98%，批号：1115-70-4)购自湖北诺纳化学公司；碘化钠(批号：201607133)、甲状腺球蛋白(10 mg/支，批号：167771)、完全弗氏佐剂(10 mg/支，批号：20160620)和不完全弗氏佐剂(10 mg/支，批号：20160801)均购自上海羽朵生物科技有限公司；促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、游离三碘甲腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)、游离甲状腺素(free thyroxine，FT4)、甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody，TGAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素(interleukin，IL)-10、IL-6、IL-12 ELISA试剂盒均购自上海茁彩生物科技有限公司；相关一抗肿瘤坏死因子受体超家族成员6(tumor necrosis factor receptor superfamily member 6，Fas，货号：ab133619)、Fas配体(Fas ligand，Fas-L，货号：ab231011)、Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associated death domain protein，FADD，货号：ab108601)、裂解半胱天冬酶-3(cleaved cysteine aspastic acid-specific protease 3，cleaved caspase-3，货号：ab32351)购自英国Abcam公司；Western裂解液(货号：P0013)购自上海碧云天生物；RNA TRIzol Reagent(批号:vs18061730)购自合肥博美生物科技有限责任公司；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪购自常州市中威电子仪器公司；BA210Digital数码三目摄像显微镜购自上海麦克奥迪公司；JY200C电泳仪购自北京君意东方电泳设备公司；PIKORed 96实时荧光定量仪购自美国ThermoFisher仪器公司。

1.3 桥本甲状腺炎大鼠模型构建及分组治疗将大鼠随机分为3组：空白组、桥本甲状腺炎组(模型组)、二甲双胍组，每组15只，适应性喂养1周后于第2周模型组及二甲双胍组饮用高碘水(碘化钠0.64 g/L)，连续2周。第4周模型组及二甲双胍组双足后皮下多点注射由完全弗氏佐剂充分乳化的油包水状的甲状腺球蛋白，每只大鼠注射100 μg，共2次，中间间隔2 d，作为初次免疫。第5周起于后背注射不完全弗氏佐剂乳化的甲状腺球蛋白(100 μg)，每周1次，共4周作为加强免疫，在此过程中空白组注射等量的0.9%氯化钠溶液，饮用纯净水，各组大鼠均取尾部血测定TSH、FT3、FT4、TGAb、TPOAb水平，评价模型是否制备成功，造模组大鼠TGAb和TPOAb水平高于空白组均值2倍及以上视为造模成功[6]。造模成功后二甲双胍组以300 mg/kg剂量灌胃[7]4周，空白组及模型组予以0.9%氯化钠溶液灌胃4周后，处死各组大鼠并取样。

1.4 检测指标

1.4.1大鼠一般情况 观察大鼠毛色、精神状态、摄食、活动情况、造模期间的束缚反应和大便质地等情况变化。

1.4.2ELISA测定甲状腺功能指标及炎性因子水平 采用戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，后将大鼠转移至预先消毒的超净工作台上，腹主动脉取血，3 000 r/min低温离心15 min分离血清，采用ELISA试剂盒测定血清中甲状腺功能指标(TSH、T3、T4、TGAb、TPOAb)水平。后采集大鼠甲状腺组织，将甲状腺组织在冰PBS中冲洗，滤纸吸干后，剪成小块，加入5 ml PBS在冰上用玻璃匀浆器匀浆，再进行2次反复冻融，进一步破碎细胞膜，匀浆物以5 000 r/min离心20 min，取上清液，按ELISA试剂盒测定甲状腺组织中炎性因子(TNF-α、IL-10、IL-6、IL-12)水平。

1.4.3HE染色观察甲状腺组织病理变化 取双侧甲状腺组织，经由4%的多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片(厚5 μm)，制片，苏木精染色4 min，脱水，伊红染色3 min，光学显微镜观察组织病理变化。

1.4.4TUNEL荧光染色检测甲状腺组织细胞凋亡 同1.4.3项制作甲状腺组织切片，然后用3% H2O2处理10 min抑制内源性过氧化物酶活性。随后将切片与TDT标记缓冲液在37 ℃孵育1 h，用DAPI复染，TUNEL阳性细胞染成绿色，细胞核DAPI染色，观察TUNEL阳性细胞。

1.4.5免疫组化检测甲状腺组织中Fas、Fas-L表达 同1.4.3项制作甲状腺组织切片，后用3% H2O2室温孵育10 min，采用高温高压柠檬酸盐缓冲液回收抗原，滴加一抗(Fas、Fas-L)4 ℃孵育过夜，滴加二抗工作液37 ℃孵育30 min，用PBS洗涤后，用DAB液孵育切片，然后用苏木精复染，中性树胶封片，光学显微镜观察并采集图像。

1.4.6Western blot测定甲状腺组织中Fas、Fas-L、FADD、cleaved caspase-3蛋白表达 取双侧甲状腺组织，在RIPA裂解缓冲液中裂解，裂解产物在4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，收集上清液。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定总蛋白，并转移到PVDF膜上。将膜与一抗Fas、Fas-L、FADD、cleaved caspase-3(均1 ∶500)或β-actin(1 ∶1 000)在4 ℃孵育过夜。然后与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG室温孵育1 h。使用ECL暗室显色，显色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系统采集图像，Image-ProPlus分析吸光度，以β-actin为内参，对照组目标蛋白质相对含量为1，计算各组蛋白质的相对表达量，实验重复3次。

1.4.7qRT-PCR检测甲状腺组织中Fas、Fas-L、FADD mRNA表达 取双侧甲状腺组织，用TRIzol试剂提取总RNA，用超纯RNA试剂盒纯化。引物序列：Fas，5′-TGTCCTGCCTCTGGTGCTTGCT-3′(正向)和5′-TTCACGAACGCTCCTCTTCAACTCCA-3′(反向)；Fas-L，5′-CTGCCTCCACTAAGCCCTC-3′(正向)和5′-TTGATACATTCCTAACCCCATTCC-3′(反向)；FADD，5′-AACCTGGTGGCTGACCTGGTGGAA-3′(正向)和5′-CCTCGGGCTTGTCAGGGTGTTTCTG-3′(反向)；GAPDH，5′-TACCCACGGCAAGTTCAA-3′(正向)和5′-ACCAGCATCACCCCATTT-3′(反向)。总RNA按制造商说明书试剂盒反转录成cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqTM定量基因表达水平，初始变性(95 ℃、10 min)，变性(95 ℃、10 s)，退火(60 ℃、10 s)，延伸(72 ℃、10 s)，40个循环。采用2-ΔΔCt法分析相对基因表达。

2 结果

2.1 二甲双胍对桥本甲状腺炎大鼠一般情况的影响所有大鼠于第1周时，饮水、进食、排便、皮毛及活动情况等均无明显异常。第4周初次免疫后，造模大鼠开始出现皮毛粗糙或脱毛、倦怠嗜卧等现象。其中二甲双胍组3只大鼠灌胃给药时出现情绪激动、烦躁易怒等现象。

2.2 二甲双胍对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺功能指标的影响与空白组比较，模型组血清中TSH、TGAb、TPOAb水平升高，FT3、FT4水平降低(P<0.01)；与模型组比较，二甲双胍组血清中TSH、TGAb、TPOAb水平降低，FT3、FT4水平升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠甲状腺功能指标比较

2.3 二甲双胍对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织病理变化的影响空白组甲状腺被膜未见增厚，小叶大小不等，小叶内可见甲状腺滤泡，多呈圆形、或卵圆形，大小不一，滤泡壁由单层滤泡细胞组成，细胞多呈立方状，滤泡腔内充满上皮分泌的滤泡胶质，间质结缔组织内血管丰富，未见变性坏死或炎细胞浸润。模型组甲状腺结构受损，局部区域滤泡结构不完整，滤泡壁较薄，滤泡细胞较为扁平甚至变性坏死，坏死细胞胞核固缩或裂解，胞质基本消失，滤泡腔内可见脱落的细胞碎片，间质内血管轻微扩张。二甲双胍组甲状腺结构较为完整清晰，滤泡大小不一，滤泡细胞多呈立方状，排列较为整齐，少量滤泡细胞变性坏死，滤泡腔内可见细胞碎片。见图1。

图1 各组大鼠甲状腺组织HE染色

2.4 二甲双胍对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织炎性因子的影响与空白组比较，模型组甲状腺组织中TNF-α、IL-6含量升高，IL-10、IL-12含量降低(P<0.01)；与模型组比较，二甲双胍组甲状腺组织中TNF-α、IL-6含量降低，IL-10、IL-12含量升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠甲状腺组织中TNF-α、IL-10、IL-6、IL-12

2.5 二甲双胍对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺细胞凋亡数的影响与空白组比较，模型组TUNEL染色阳性细胞比率增加(P<0.01)；与模型组比较，二甲双胍组TUNEL染色阳性细胞比率降低(P<0.01)。见图2。

图2 各组大鼠甲状腺细胞凋亡数的影响 ×400

2.6 二甲双胍对桥本甲状腺炎大鼠Fas/Fas-L途径的影响免疫组化染色结果显示，与空白组比较，模型组甲状腺组织中Fas、Fas-L表达升高(P<0.01)；与模型组比较，二甲双胍组甲状腺组织中Fas表达降低(P<0.05)，Fas-L表达无差异统计学意义(图3A、B)。qRT-PCR检测结果显示，与空白组比较，模型组甲状腺组织中Fas、Fas-L、FADD mRNA表达均升高(P<0.01)；与模型组比较，二甲双胍组甲状腺组织中Fas、Fas-L、FADD mRNA表达均降低(P<0.05)(图3D)。Western blot检测结果显示，与空白组比较，模型组甲状腺组织中Fas、Fas-L、FADD、cleaved caspase-3蛋白表达升高(P<0.01)；与模型组比较，二甲双胍组甲状腺组织中Fas、Fas-L、FADD、cleaved caspase-3蛋白表达降低(P<0.01)(图3C、E)。

图3 各组大鼠甲状腺组织Fas、Fas-L表达

3 讨论

HT是发病率极高的自身免疫疾病，其以抗甲状腺球蛋白和甲状腺过氧化物酶抗体为特征，大多数HT患者血清TPOAb和TGAb均为阳性；TPOAb和TGAb不仅可作为HT的诊断标志物，同时也是HT临床治疗及预后的重要依据，TPOAb、TGAb可通过抗体-补体系统介导的T细胞活化引起甲状腺细胞损伤[8]。Prummel et al[9]研究表明TPOAb抗体水平与TSH水平和甲状腺组织中淋巴细胞浸润密切相关。因此，降低TGAb、TPOAb水平是HT治疗的一个重要目标。此外，研究[10]报道在甲状腺全切除术后接受左旋甲状腺素(LT4)单一治疗的患者中，TSH水平与血清FT3水平偏低有关，相反，在甲状腺体积增大的HT患者中血清FT3水平往往较高，FT4水平较低，FT3/FT4比值较高。因此，甲状腺体积增大可能是影响甲状腺激素平衡的重要因素，包括FT3、FT4水平。该研究中，HT大鼠甲状腺组织中有炎性浸润，且HT大鼠血清TSH、TGAb、TPOAb水平均高于空白组，FT3、FT4水平低于空白组(P<0.01)，经二甲双胍治疗后HT大鼠血清TSH、TGAb、TPOAb水平降低，FT3、FT4水平升高(P<0.05)，甲状腺组织病理变化明显改善，说明二甲双胍抑制HT进展。该研究得到了先前研究[11]的证实，这些研究报道了某些化合物，如加减海藻玉壶汤等，能够逆转HT大鼠血清FT3、FT4、TGAb、TPOAb水平及甲状腺组织病理学改变，从而对HT大鼠具有明显的保护作用。此外，研究[12]表明细胞凋亡是甲状腺细胞死亡的主要机制，不同功能的促甲状腺激素受体抗体可诱导甲状腺细胞存活、增殖或诱导细胞死亡。该研究显示，二甲双胍治疗后甲状腺组织TUNEL染色阳性细胞比率降低(P<0.01)，表明二甲双胍在一定程度上抑制甲状腺细胞的凋亡。以上结果提示，二甲双胍对HT大鼠具有良好的治疗效果。

TNF-α、IL-6、IL-12 均为Th1型细胞因子，而IL-10为Th2型细胞因子，Th1因子产生高水平的干扰素γ，干扰素γ进而促进巨噬细胞活化，进一步产生 TNF-α、IL-1、IL-6和活性氧等炎性介质而导致甲状腺组织的破坏[13]。该研究结果显示二甲双胍治疗后甲状腺组织中TNF-α、IL-6含量降低，IL-10、IL-12含量升高(P<0.05)，说明二甲双胍可使Th1/Th2之间平衡，与李婵 等[14]的研究一致。此外，研究表明几乎所有的甲状腺癌标本(97%)免疫组化染色显示Fas蛋白的存在，而临近的正常甲状腺滤泡Fas免疫反应性较低，且caspase依赖的细胞凋亡是由Fas/Fas-L途径触发的，Fas-L激活Fas受体，Fas受体通过招募FADD传递信号，Fas-FADD招募proaspase-8，结合形成Fas-FADD-proaspase-8复合物。自我切割proaspase-8激活caspase-8作为细胞凋亡的起始caspase，caspase-8同时激活caspase-3，caspase-3执行细胞凋亡[15]。Boechat et al[16]研究显示自发性甲状腺炎小鼠甲状腺组织Fas存在不同表达。该研究结果显示，模型组甲状腺组织中Fas、Fas-L、FADD、cleaved caspase-3表达较空白组升高，二甲双胍治疗后甲状腺组织中Fas、Fas-L、FADD、cleaved caspase-3表达降低(P<0.05)，与Boechat et al[16]研究一致。上述结果提示二甲双胍通过恢复Th1/Th2平衡及抑制Fas/Fas-L介导的细胞凋亡途径缓解HT症状。

综上所述，二甲双胍可降低雌性大鼠桥本甲状腺炎相关自身抗体和甲状腺激素水平，抑制桥本甲状腺炎发展，其作用机制可能与抑制Fas/Fas-L介导的细胞凋亡途径有关。