硼酸钠-冰醋酸亚甲蓝染色法检测幽门螺旋杆菌效果评价

邓士杰，喻朝霞

(安徽医科大学附属安庆市第一人民医院 病理科，安徽 安庆 246000)

研究发现幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylorus，Hp)感染与80%的胃溃疡和90%的十二指肠溃疡有关[1],各个年龄段的人群均有感染[2]，在发展中国家感染率为50.8%，发达国家感染率为34.7%[3]。我国人口众多，感染基数大，因此必须重视Hp的早诊早治。上级医院开展较多的是免疫组织化学法，而Giemsa法和硼酸亚甲蓝法仍然是基层医院较为经济可靠的检测方法[4-5]。硼酸亚甲蓝法染色后菌体淡染呈针尖样，点状排列，需要在高倍镜下仔细观察，大量阅片后易引起视觉疲劳。如果将硼酸钠替换硼酸配置染液同时加入3%冰醋酸，笔者发现菌体颜色较深，易于分辨。本研究拟对两种染色方法进行比较，探讨硼酸钠-冰醋酸亚甲蓝法在Hp检测中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 标本选取与分组 收集安庆市第一人民医院病理科2019～2020年胃窦部活检Hp确诊标本62例，性别和年龄不限。根据Giemsa染色情况和《中国慢性胃炎共识意见2017.上海》[6]将确诊标本分成轻度感染组(32例)、中度感染组(19例)和重度感染组(11例)，每组连续切片2张，分别行硼酸亚甲蓝染色和硼酸钠-冰醋酸亚甲蓝染色。

1.2 主要试剂及设备 亚甲基蓝(比克曼生物)，硼酸与硼酸钠(国药集团)，蒸馏水，冰醋酸，徕卡2235切片机，莱卡sp300脱水机，奥林巴斯显微镜。

1.3 方法

1.3.1 试剂配制 硼酸亚甲蓝法：蒸馏水400 mL中加入硼酸2 g，搅拌至完全溶解，加入美蓝4 g，充分搅拌混合后过滤，盛入避光密封瓶，置于4℃冰箱保存。硼酸钠-冰醋酸亚甲蓝法：蒸馏水400 mL中加入硼酸钠2 g，搅拌至完全溶解，加入美蓝4 g，充分搅拌混合后过滤，盛入避光密封瓶，加入3%冰醋酸5 mL，室温保存。

1.3.2 Hp感染程度判读标准 按《中国慢性胃炎共识意见2017.上海》[6]判读Hp，观察胃黏膜黏液层、表面上皮、小凹上皮和腺管上皮表面的Hp。无：特殊染色片上未见Hp；轻度：偶见或小于标本全长1/3有少数Hp；中度：Hp分布超过标本全长1/3而未达2/3或连续、薄而稀疏地存在于上皮表面；重度：Hp成堆存在，基本分布于标本全长。

1.3.3 染色步骤 硼酸亚甲蓝法：切片脱蜡至水，硼酸亚甲蓝染液2 min，蒸馏水洗10 s，烘干，二甲苯透明，中性树胶封片。硼酸钠-冰醋酸亚甲蓝法：切片脱蜡至水，硼酸钠亚甲蓝染液15 s，水洗3 s，95%乙醇分化2 s，水洗3 s，快速脱水10 s，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.4 统计方法 采用SPSS 18.0进行统计学分析，计数资料用百分比表示，采用矫正配对χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法染色效果 图1A显示，硼酸钠-冰醋酸亚甲蓝400倍镜下，Hp呈蓝色，染色较深，菌体清晰分布于胃小凹中；图1B显示，硼酸亚甲蓝染色400倍镜下，Hp呈淡蓝色，菌体模糊不清。

图1 硼酸钠-冰醋酸、硼酸亚甲蓝染色(10×40)

2.2 两种染色方法在不同分组中的检出率 重度组：两种染色方法检出率均为100%(11/11)。中度组：硼酸钠-冰醋酸亚甲蓝染色检出率为100%(19/19)；硼酸亚甲蓝染色检出率为89.47%(17/19)。轻度组：硼酸钠-冰醋酸亚甲蓝检出率为90.63%(29/32)；硼酸亚甲蓝染色检出率为68.75%(22/32)，且硼酸钠-冰醋酸亚甲蓝检出率高于硼酸亚甲蓝，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 两种染色方法在3组中染色情况比较

3 讨论

Hp检测方法较多，尿素呼气试验方法(urea breath test,UBT)快捷，适用于儿童和孕妇[7]，但是价格较贵；N15-尿氨排出试验与UBT原理相同，易受肝肾功能[8]和食用益生菌影响[9]而出现假阴性结果；血清学检查具有较高的灵敏度和特异度，但Hp根除治疗后抗体能存在6个月以上[10]，因此血清学检查不能反映现症感染。组织学检测被认为是诊断Hp的金标准，且与胃黏膜炎症反应呈正相关[11]。目前临床病理Hp检查方法使用较多的是免疫组织化学法和特殊染色法，而本研究使用硼酸钠-冰醋酸亚甲蓝染色成本低廉，方法简单快捷，易普及。

从染色时间看，硼酸亚甲蓝染色时间>2 min，而硼酸钠-冰醋酸亚甲蓝染色时间仅为33 s，这将大大减轻技术员的工作负担。硼酸钠-冰醋酸亚甲蓝染液时长至少需要15 s，尤其轻度感染菌体较少的情况下，如果时间过短染液结合不牢，经过95%乙醇洗脱和下一步酒精梯度脱水后使得菌体染色变淡，容易出现假阴性。硼酸亚甲蓝染液染色时长跟菌体着色深浅有关，过长的染色时间使得染液过多结合于菌体和胃黏膜表面，由于直接烘干，背景常有透明颗粒和蓝色颗粒，严重影响Hp的判读。硼酸钠-冰醋酸亚甲蓝染色经95%酒精洗去黏膜黏液层、表面上皮、小凹上皮和腺管上皮多余染液，使得菌体清晰可辨。

Hp中度感染组和重度感染组两种染色方法均具有较高的检出率，可能与胃黏膜内菌体数量较多，容易检出有关。轻度组中硼酸钠-冰醋酸亚甲蓝染色检出率高于硼酸亚甲蓝染色，笔者认为可能原因是弱碱性的硼酸钠配置的染液易与呈弱酸性的Hp菌体表面结合，不易被95%酒精洗脱使菌体更加清晰，即使胃黏膜内有少量的Hp菌体也容易被检出。两种检测方法在轻度感染组检出率都不同程度降低，可能原因是蜡块经过多次深切后，残存Hp菌体较少，使得两种染色方法的检出率下降。通过初次切片保留较多的Hp菌体和提高样本量来进一步观察两种染色方法在轻度感染组的染色效果，这将是我们下一步的工作重点。

综上所述，虽然两种染色方法都能满足常规诊断需要，但是硼酸钠-冰醋酸亚甲蓝染色无论染色时间还是染色效果均优于硼酸亚甲蓝染色，基层医院可以结合自身实际情况采用硼酸钠-冰醋酸亚甲蓝染色来提高Hp的检出率。