PKN2调控AKT/mTOR通路促进周围神经损伤修复的机制

胡旭峰，王 林

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 创伤骨科，安徽 芜湖 241001)

周围神经损伤(peripheral nerve injury，PNI)在临床中极为常见，可引起患者感觉退化和自主功能丧失，给患者工作和生活带来极大不便[1-2]。研究证实，周围神经在损伤后具有修复再生的能力，因此，促进周围神经再生成为当前的医学研究热点之一[3-4]，深入研究周围神经的损伤修复机制成为其中关键环节。研究显示，丝苏氨酸蛋白激酶(protein kinase B，PKB亦称作AKT)信号通路作为具有多个磷酸化调控位点的信号通路，在神经系统的调控中起着关键作用，其可通过与雷帕霉素靶蛋白(mammaliantarget of rapamycin,mTOR)作用介导周围神经再生，有研究认为mTOR的减少与中枢神经系统再生能力下降有关，mTOR可介导中枢神经系统损伤后的神经修复和再生[5-7]，蛋白激酶N2(protein kinase N2,PKN2)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛分布于细胞膜和细胞质中，其激酶活性区域位于c端[8]。最新研究发现PKN2能促进小鼠胚胎发育和神经嵴迁移，是神经再生和神经发育的关键步骤[8]，PKN2可通过调控AKT/mTOR通路促进PC12细胞再生[9]，然而，PKN2通过AKT/mTOR通路能否调节神经元凋亡和促进周围神经再生尚不清楚。因此，本研究拟确定PKN2在PNI修复中的作用机制，为PNI的治疗提供新思路和新方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料 清洁级SD大鼠50只，重组人PKN2蛋白(美国Abcam)，兔抗大鼠PKN2、AKT、mTOR单抗隆抗体(美国Abcam)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗、PCNA免疫荧光检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，DAPI和抗荧光衰减封片剂(武汉谷歌)，甲苯胺蓝染色液(美国Sigma)，电泳仪(美国BIO-RAD)，倒置荧光显微镜(德国Carl Zeiss)，Sartoris天平(德国Sartoris)。

1.2 坐骨神经损伤模型制备 50只大鼠均腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，暴露右侧坐骨神经，用无齿镊钳夹坐骨神经，每次10 s，间隔30 s，重复5次，抗生素抗感染治疗，随后逐层缝合肌肉、皮肤。正常对照组10只大鼠不做任何处理。

1.3 PKN2干预方法 模型制备成功后3周，麻醉后暴露神经，模型大鼠分为4组，每组10只，模型组注射5 μL PBS，重组PKN2(rhPKN2)低、中、高剂量组：Hamilton微量注射器在损伤处由远侧到近侧分别缓慢注射10 ng/μL的rhPKN2 5 μL、10 μL和20 μL。每周1次，连续注射4周。

1.4 大鼠坐骨神经指数(sciatic nerve index，SFI)测定 大鼠于干预后每周进行步态分析，准备50 cm长、8 cm宽的长方形盒子，避光处理，白纸平整铺于底部，大鼠双侧后足底均匀涂抹墨水，盒内自由行走，分别记录健侧(E)与患侧(N)的足印长度(podogram length,PL)、足趾宽度(width between the first and fifth toes,TW)和中间足趾距离(inter-toes distance,IT)。坐骨神经指数计算公式为：SFI=-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETW-NTW)/NTW+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8[10]。

1.5 股三头肌肌湿重测量 切取麻醉大鼠患侧与健侧股三头肌，称重，计算术侧与健侧质量比，比值越小，代表肌肉萎缩越明显。

1.6 甲苯胺蓝染色观察髓鞘结构 取大鼠坐骨神经远端，4℃环境下，2.5%戊二醛固定过夜，1%四氧化锇固定2 h，乙醇脱水，石蜡包埋，制备1 μm厚度的切片，0.5%的甲苯胺蓝染色30 min，随后水洗，20%醋酸浸泡，水洗3次，封片，置于光学显微镜下观察并计数。

1.7 TUNEL染色检测细胞凋亡情况 组织切片经脱蜡和脱水，随后于PBS中浸泡，甩干多余水分，加100 μL蛋白酶K(1∶1 000稀释于10 mmol/L Tris-CL中)，室温孵育20 min;PBS清洗5 min×3次；分别加入50 μL TUNE混合液，37℃摇床避光孵育1 h；PBS清洗5 min×3次，滴加DAPI工作液室温避光孵育30 min；PBS清洗5 min×3次，加入防荧光淬灭剂，封片；荧光显微镜下观察致密高亮的红色荧光细胞核与对应的DAPI蓝色荧光细胞，合并后呈粉红色的则为凋亡细胞核。

1.8 Western blot检测蛋白表达情况 收集各组坐骨神经组织，RIPA裂解。离心后取上清，依据BCA法测定蛋白浓度。以GAPDH作为内参，SDS-PAGE电泳。随后转至PVDF膜，5%BSA封闭1 h，TBST清洗3次，应用PKN2、AKT和mTOR单克隆抗体一抗在4℃孵育过夜。最后使用辣根过氧化酶二抗(1∶5 000)孵育并加入ECL显色液显色成像。

2 结果

2.1 各组大鼠SFI比较 与正常组相比，模型组大鼠SFI均下降(P<0.05)；与模型组相比，各剂量组SFI均增加(P<0.05)；与低、中剂量组相比，高剂量组SFI增加(P<0.05)，见图1。

2.2 各组大鼠股三头肌肌湿重比较 与正常组相比，模型组肌湿重比值下降(P<0.05)；与模型组相比，各剂量组肌湿重比值均增加(P<0.05)；与低、中剂量组相比，高剂量组肌湿重比值增加(P<0.05)，见表1。

与正常组相比，&P<0.05；与模型组相比，*P<0.05；与低、中剂量组相比，#P<0.05。

2.3 各组大鼠神经纤维再生情况比较 与正常组相比，模型组有髓神经纤维数量减少(P<0.05)；与模型组相比，各剂量组有髓神经纤维数量均增加(P<0.05)；与低、中剂量组相比，高剂量组有髓神经纤维数量增加(P<0.05)，见表1。

2.4 各组大鼠神经细胞凋亡情况比较 与正常组相比，模型组神经细胞凋亡数量增加(P<0.05)，与模型组相比，各剂量组神经细胞凋亡数量均减少(P<0.05)；与低、中剂量组相比，高剂量组神经细胞凋亡数量减少(P<0.05)，见表1。

2.5 各组大鼠蛋白表达情况比较 与正常组相比，模型组PKN2、AKT和mTOR蛋白下调(P<0.05)，与模型组相比，各剂量组PKN2、AKT和mTOR蛋白均上调(P<0.05)；与低、中剂量组相比，高剂量组PKN2、AKT和mTOR蛋白上调(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠三头肌湿重、有髓神经纤维数量、神经细胞凋亡及相关标志蛋白表达比较

3 讨论

PNI是常见临床疾病，其损伤后可激活神经元天然的再生能力，从而修复再生神经断端的轴突。修复PNI的关键是保护神经元和促进轴突再生[11]，然而，周围神经轴突的再生过程极其复杂，牵涉到众多过程，其具体机制尚未明确。因此，加强再生机制的研究，有助于提供有效的潜在治疗靶点。

PKN2是一种蛋白激酶c相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在多种细胞通路中作为多个氨基酸单亚基信号多肽效应因子。PKN2在细胞周期进程、细胞迁移、细胞黏附和转录激活信号通路中起重要作用[12-13]。最新研究发现PKN2能促进小鼠胚胎发育和神经嵴迁移，是神经再生和神经发育的关键步骤[8]。研究表明PKN2可以通过结合突触后密度蛋白结构域结构域与酪氨酸磷酸酶结合，PKN2还具有Sr3同源性3(SRC homology3 domain,SH3)结构域，SH3结构域是Rho信号通路的潜在效应部位[14]。本课题组前期研究显示，PNI模型大鼠中PKN2呈低表达，并且与AKT和mTOR蛋白呈正相关，而AKT/mTOR通路在神经损伤中呈现异常表达，已有充足的研究证据表明该通路参与中枢神经的损伤过程[15]，且PKN2具有靶向调节AKT/mTOR通路的作用[9]。因此，为进一步探究PKN2在PNI中的作用机制，本研究采用经典方法制备PNI模型，并用重组PKN2蛋白注射，以提高PKN2蛋白水平，观察其对运动功能和神经再生指标的影响，结果显示模型组大鼠SFI较正常组大鼠明显下降，而给予重组PKN2蛋白后，SFI增幅明显优于模型组，且呈剂量效应，表明重组PKN2蛋白可以有效改善损伤后的运动功能，肌湿重比值亦可反映肌肉萎缩情况，重组PKN2蛋白干预后大鼠肌肉萎缩得到明显逆转，亦能间接证明重组PKN2蛋白对神经元的恢复发挥了重要的促进作用。通过甲苯胺蓝染色新生髓鞘数量，统计分析损伤后再生的神经纤维，客观直接判断重组PKN2蛋白对神经纤维再生的影响，本研究显示重组PKN2蛋白可促进有髓神经纤维的再生数量，明显促进神经元修复和再生。凋亡速度亦是反映损伤神经再生的重要指标，本研究显示，重组PKN2蛋白明显抑制了神经元的凋亡，有利于神经元成熟和再生。最后，为验证PKN2对AKT/mTOR通路的影响，Western blot结果显示，其在注射重组

PKN2后明显上调，表明PKN2对AKT/mTOR通路具有直接的调控作用，进一步表明PKN2通过对AKT/mTOR通路的调控促进了PNI后神经元的分化和再生能力，为PNI的治疗提供了理论依据。