消癌平注射液促进肺腺癌细胞凋亡的分子机制研究

陈欣德，周 帅，张茂容，吴志浩,2

(皖南医学院 1．肿瘤微环境研究室;2．医学生物学教研室，安徽 芜湖 241002)

通关藤是萝藦科牛奶菜属植物通关藤的干燥藤茎，有别名称乌古藤、通光散、大苦藤、地甘草、鸟古藤、下奶藤及勒藤，长2～6米，花开在夏季；主要分布在我国的贵州、云南、四川等地[1]，具有清热解毒、缓解咳嗽及哮喘、消除疼痛等作用。此外，《云南药典》和《中华人民共和国药典(1977年版)》记载通关藤可以用于消炎抗癌[2]。通关藤含有多种化学成分，包括甾体苷类、多糖类、生物碱类[3]，通关藤提取物在体外对肺癌、肝癌、胃癌等癌症具有抑制作用[4]。目前临床上用的最多的剂型是消癌平注射液，且大都与一线抗癌药物如紫杉醇、吉非替尼、顺铂、5-氟尿嘧啶等联合用药。消癌平注射液是由药用植物通关藤的干燥藤茎经低温提取、生物分离及高科技离子交换萃取等现代中药制作提取方法提取而成，保留了药物中的活性成分。消癌平注射液主要应用于化疗、放疗以及术后的药物辅助治疗[4]；其毒性非常小，且能在一定程度上提高患者的机体免疫力，是中药抗癌的代表之一，在临床上取得了一定的治疗效果。据文献报道，消癌平注射液具有治疗多种癌症的临床背景，但是其具体的抗肿瘤机制尚不明确。本文研究结果显示，消癌平注射液能够抑制细胞活力，使细胞周期停滞并且促进细胞的凋亡来发挥其抗肿瘤作用。

肺癌是全世界发病率和病死率最高的恶性肿瘤[5]。由于常规检查很难发现肺癌的存在，所以一般发现时大多数患者已处晚期[6]，手术已很难治愈。虽然近年来针对肺癌治疗及预后的研究取得了较大进展，但是肺癌的总体生存率还是较低。这是由于肺癌属于转移性肿瘤，其侵袭性及转移性都很强，常规治疗如手术、放疗、化疗等均无良好的疗效。

GSK-3β在多种信号通路及多种癌症中扮演着十分重要的角色，其参与信号的传导以激活或者抑制下游靶基因的表达，其参与调控的凋亡通路中包括NF-κB通路以及线粒体介导的凋亡通路。在本研究中，我们证明了消癌平注射液通过GSK-3β-NF-κB-Bcl-2轴促进肺腺癌细胞系A549、H1299的凋亡，这些结果表明了消癌平注射液可以作为化疗以及一线抗癌药物的辅助药物的依据。为今后临床上关于肿瘤的药物治疗提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株 A549、H1299细胞(人源非小细胞肺腺癌上皮细胞系，ATCC)；HBE细胞(人正常支气管样上皮细胞，ATCC)。

1.2 药品与试剂 消癌平注射液(南京圣和药业股份有限公司，批号202006241，国药准字Z20025868，缩写为XAP)；NF-κB抗体、Actin抗体、GSK-3β抗体、β-catenin抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体购于CST公司；小牛血清、DMEM(Gibco公司，美国)；GSK-3β抑制剂(Merck公司，美国)；1.5 mol/L Tris-HCl(pH=8.8)、1 mol/L Tris-HCl(pH=6.8)、APS、SDS、丽春红染液、MTT、TEMED(碧云天公司，中国)；NC膜(PALL公司，美国)；流式细胞术试剂盒(凯基生物公司，中国)；鼠抗、兔抗(CST公司，美国)；顺铂(齐鲁制药有限公司，批号8A001A88，国药准字H37021357，缩写为DDP)。

1.3 主要仪器 CO2细胞培养箱(Eppendorf公司，德国)；BioTek酶标仪(伯腾公司，美国)；离心机(Eppendorf公司，德国)；金属浴D1100-230v(Labent AccuBlock公司，美国)；4℃水平摇床(New Brunswick公司，美国)；电泳仪、小型垂直电泳槽(BioRad公司，美国)。

1.4 方法

1.4.1 细胞复苏 将人非小细胞肺腺癌A549、H1299细胞从-80℃冰箱中取出，放入提前预热的37℃水浴锅中轻轻摇晃，待剩余少许冰块时停止摇晃，放入超净台中加入1 mL含10%新生小牛血清和抗生素的DMEM培养基中缓缓打匀。1 500 r/min离心4 min后吸走上清，加入1 mL含有10%新生小牛血清和抗生素的DMEM培养基打匀，接着打入事先准备好的含有7～8 mL培养基的培养皿中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

1.4.2 MTT实验 细胞接种于48孔板中，待细胞密度长至80%～90%时饥饿12 h，分别按照以下分组：阴性对照组，消癌平注射液组(1、2、3、4、5 μg/μL)各组设4组复孔。待48 h后，吸去上清液，加入新配制的0.5 μg/mL的MTT溶液每孔400 μL，处理4 h后用移液枪缓慢吸取液体，每孔加入300 μL的二甲亚砜，摇床避光震荡15 min，在酶标仪上测定570 nm处的吸光度。根据公式：细胞抑制率(inhibitor rate，IR)=(对照组吸光度值-实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100%，计算每组抑制率。

1.4.3 流式细胞术测凋亡与周期 将胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞接种于6孔板，待细胞密度长至80%～90%时饥饿过夜，设置阴性对照组，加药组加入消癌平注射液(5 μg/μL)处理24 h，阳性对照组加入顺铂(10 μmol/L)处理5 h。于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，胰蛋白酶消化后离心收集细胞，再用1 mL PBS清洗1次，取得细胞分为凋亡组与周期组。凋亡组:加入400 μL 1×Binding Buffer 将细胞打匀，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL的PI染液。轻轻打匀并在室温下黑暗中孵育15 min。周期组:用75%的冰乙醇水溶液固定过夜，加入450 μL的PI染液和50 μL的RNase A溶液，轻轻打匀后避光静置30 min。所得样品经过滤后用流式细胞仪检测实验结果并用Flowjo软件分析。

1.4.4 Western blot实验 胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞并接种于6孔板，待6孔板中细胞密度达到80%～90%时，饥饿12 h。分别加入0、1、2、3、4、5 μg/μL的消癌平注射液处理24 h后收样，使用LaemmLi sample buffer裂解液收集细胞，进行电泳跑胶转膜封闭，所剪的蛋白条带在4℃低温摇床中孵育对应的一抗过夜后，TBST洗膜(每次5 min，洗3次)，室温孵育相应二抗1 h，再次洗膜(每次5 min，洗3次)，最后进行曝光(AI600化学发光成像仪中显影)。

1.4.5 质粒DNA转染和siRNA转染 细胞铺于6孔板中至密度达到80%时，将细胞培养基更换为无青链霉素的培养基，培养30 min后转染cDNA和siRNA，6～8 h后更换为普通培养基，36 h后用DMEM饥饿处理12 h，加入不同浓度的消癌平注射液处理24 h。NF-κB siRNA的正义链序列为5′GCGACAGGUGCAGA-AAGAdTdT3，反义链序列为3′dTdTCGCUGUUCCACGUCUUUCU5。

2 结果

2.1 消癌平注射液对A549、H1299、HBE细胞增殖的影响 MTT结果显示，与0 μg/μL组相比，在A549细胞系中，浓度达2 μg/μL后随消癌平注射液浓度梯度的增加，对细胞均有抑制作用(F=118.90,P<0.05)。在H1299细胞系中，浓度达3 μg/μL后随着消癌平注射液浓度梯度的增加，对细胞均有抑制作用(F=29.99,P<0.05)。而不同浓度消癌平注射液对肺正常上皮细胞(HBE)抑制差异无统计学意义(F=3.97,P>0.05)。见图1。

2.2 消癌平注射液对A549、H1299细胞凋亡的影响 与阴性对照组相比，消癌平注射液组与顺铂组早期凋亡细胞增多(P<0.05)。消癌平注射液组与顺铂组早期凋亡细胞之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

2.3 消癌平注射液对A549、H1299细胞周期的影响 与阴性对照组相比，消癌平注射液组与顺铂组停滞于G0/G1期细胞增多(P<0.05)。消癌平注射液组与顺铂组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.4 消癌平注射液通过GSK-3β-NF-κB-Bcl-2轴促进A549、H1299细胞的凋亡 Western blot结果显示，6孔板内分别加入消癌平注射液浓度为0、1、2、3、4、5 μg/μL处理24 h后收样，GSK-3β表达量不变，p-GSK-3βSer9、NF-κB、Bcl-2蛋白量下降，Bax蛋白量上升。见图4。

图4 消癌平注射液通过GSK-3β-NF-κB-Bcl-2轴促进细胞的凋亡

2.5 用GSK-3β抑制剂验证消癌平注射液对A549、H1299细胞的凋亡作用 向加入消癌平注射液(4 μg/μL)的细胞中加入GSK-3β抑制剂(20 μmol/L)处理5 h后与未加入GSK-3β抑制剂的细胞和阴性对照组相比较，通过Western blot实验我们发现GSK-3β的磷酸化水平及下游靶蛋白水平恢复，说明消癌平注射液通过激活GSK-3β的活性来抑制下游靶基因的蛋白水平，进一步验证了消癌平注射液对肺腺癌A549、H1299细胞的作用机制(图7～8)。

图5 过表达GSK-3β cDNA

图6 转染NF-κB siRNA

图7 加入GSK-3β抑制剂后下游靶蛋白恢复

图8 单独加入GSK-3β抑制剂后检测其对GSK-3β-NF-κB-Bcl-2轴的影响

3 讨论

细胞凋亡是受细胞内相关基因调控的一种正常的生物学过程，是细胞的一种程序性死亡[7]。在维持内环境稳定，调控生物在发育，进化过程中起重要的作用[8]。而在肿瘤细胞中，由于肿瘤细胞的恶性增殖，分化程度低等，为维持肿瘤细胞的特性，与正常细胞相比较，有一些基因的表达量发生改变，从而引起蛋白水平的改变并最终改变细胞的特性。

在众多的凋亡家族基因中，Bcl-2是十分重要的一种抗凋亡因子，其在多种肿瘤细胞内高表达。它虽然不影响细胞增殖，但是可以阻滞细胞的凋亡[9]。Bcl-2与促凋亡因子Bax相互拮抗，可结合成为异源二聚体[10]，拮抗细胞的凋亡。在正常情况下，抗凋亡基因Bcl-2抑制细胞的凋亡，而当细胞处于应激状态时，促凋亡基因Bax会被释放到并转移至线粒体外膜，提高线粒体膜通透性而引发级联反应，促使细胞的凋亡[11]。

NF-κB是1986年发现的一种重要的转录因子，最常见的是p65与p50结合形成的二聚体。它的作用为通过抵抗细胞凋亡而使肿瘤细胞存活，其作为转录调节因子调控多种靶基因的表达，调节范围较广。而先前的研究报道中有研究者证明Bcl-2的启动子上有NF-κB的结合位点[12]，再根据我们的实验结果在蛋白水平上Bcl-2随着NF-κB下降而下降，进一步证明了NF-κB能够调节Bcl-2的表达。

GSK-3β，一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是一种双特异性激酶，已被视为多种人类癌症的潜在治疗靶点。在不同的癌症以及不同的信号通路中GSK-3β扮演的角色不同。当第9位的丝氨酸位点被磷酸化以后会导致GSK-3β的活性受到抑制。而根据文献报道NF-κB的活性又受到GSK-3β激活的调节[13-14]，我们在研究中也发现p-GSK-3βSer9下降，所以我们猜想消癌平注射液可能通过GSK-3β-NF-κB-Bcl-2轴促进肺腺癌细胞A549、H1299的凋亡。为了验证消癌平注射液是否通过GSK-3β-NF-κB-Bcl-2轴调控细胞的凋亡，本研究又引入了GSK-3β的抑制剂进一步证明了消癌平注射液通过GSK-3β-NF-κB-Bcl-2轴促进肺腺癌细胞A549、H1299的凋亡。

总之，消癌平注射液促进肺腺癌细胞A549、H1299的凋亡，其机制是通过调控GSK-3β-NF-κB-Bcl-2轴来发挥作用。