越鞠丸对慢性不可预见性应激导致抑郁样行为模型大鼠学习记忆的影响

张芯悦，梁 坤，沈国晴，冯清源，李光建，傅丹敏，胡安冉，汪萌芽，黄宏平

(皖南医学院 1.启明星小组；2.生理学与神经生物学教研室，安徽 芜湖 241002)

抑郁症又称抑郁障碍,以显著而持久的心境低落为主要临床特征[1]，是一种严重危害公众健康的疾病。研究发现，抑郁症患者常伴有认知功能损害,主要表现为注意力、学习记忆及执行功能等障碍[2]，其中学习记忆功能是认知活动中的重要方面。近年来，许多临床工作者对中医药治疗抑郁症引发的学习记忆障碍的疗效及可能的作用机制的研究指出，抗抑郁的中药制剂在某些认知功能的改善上优于西药[3],这可能为中医药治疗抑郁症开辟了一条新途径。抑郁症在我国中医学中属于“郁证”范畴，越鞠丸作为治疗郁证的代表方剂，在临床上还具有支持快速持久抗抑郁的作用[4]。有研究者基于新颖物体识别范式实验，发现越鞠丸醇提物可以调节强迫游泳模型小鼠应激诱导的记忆障碍[5]，提示越鞠丸可能成为新的治疗应激诱导学习记忆障碍的潜在药物。本研究进一步探究越鞠丸对慢性不可预见性应激(chronic unpredictable stress，CUS)导致抑郁样行为模型大鼠学习记忆功能的影响，为抗抑郁中药治疗应激导致的学习记忆障碍提供实验参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠28只，体质量160～190 g，由南京青龙山动物繁殖场提供，许可证号SCXK(苏)2017-0001。

1.2 仪器和药品 44 cm×44 cm×47 cm大鼠旷场实验箱(Panlab，USA)，Y型迷宫(MG-2型迷宫刺激器)由张家港市教学实验器械厂提供，Morris水迷宫水池由实验室参照文献自制[6]，越鞠丸购自安徽省亳州市谯城区华佗镇华佗拾遗中医馆。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及给药 将28只雄性SD大鼠(160～190 g)分为正常组(n=9)、抑郁组(n=10)和越鞠丸组(n=9)。根据动物给药剂量换算公式与越鞠丸使用说明书，大鼠每日剂量为3 g/kg。将越鞠丸放入超纯水中，使用磁力搅拌器进行溶解，配置越鞠丸溶液。越鞠丸组与抑郁组造模完成后，对越鞠丸组持续21 d灌胃给药越鞠丸溶液(1 mL/100 g)，正常组和抑郁组灌胃给予相同剂量的超纯水(1 mL/100 g)。

1.3.2 CUS导致抑郁样行为模型大鼠制备 根据旷场实验评分将大鼠分组[7]，选择得分高的9只大鼠作为正常组，其余随机分为抑郁组和越鞠丸组，并对其进行抑郁样行为模型制备，即孤笼饲养的同时连续3周进行CUS，包括24 h禁食、24 h禁水、24 h潮湿垫料、5 min水平摇晃、4℃冰水浴5 min、夹尾1 min、电击30 min，每种刺激不连续出现2次。

1.3.3 CUS导致抑郁样行为模型大鼠鉴定

1.3.3.1 糖水偏爱实验 在文献[8]方法上稍加变动，正式测试前训练大鼠饮用浓度为2%的糖水。训练结束后断水24 h开始测试，给予每只大鼠两瓶容量为100 mL的水壶，分别为糖水和纯净水，2 h后对水壶余量进行称量，计算每只大鼠的糖水偏爱率。

1.3.3.2 旷场实验 依次将每只大鼠放入旷场箱，测试时长为5 min，实验人员在旁记录，当大鼠4只爪同时爬入一格中计为水平得分1分，当大鼠2只前爪同时腾空远离地面计为垂直得分1分，分别统计水平和垂直分数[9]，最后计算总得分。

1.3.4 空间学习记忆检测

1.3.4.1 Morris水迷宫实验 将水池等分成4个象限，实验前一天依次将每只大鼠放至可视平台适应15 s，结束后换成透明不可视平台，实验时将大鼠背向平台、面向池壁自4个象限的标记点随机放入，记录大鼠找到平台的时间为逃避潜伏期，连续5 d重复上述步骤。在最后一天的定位航行结束1 h后撤掉平台，将大鼠随机从任一象限标记点背向水池置入池中1次，记录大鼠1 min内到达目标象限所需的时间、在目标象限停留的时间和穿越虚拟平台的次数[10]。

1.3.4.2 Y迷宫实验 由3条臂[42 cm×15 cm×13 cm(长×宽×高)]组成。随机将3条臂分成起始臂、其他臂与新异臂，实验前3 d关闭新异臂，训练大鼠适应环境。正式测试时，将新异臂打开，依次将大鼠自起始臂放入，记录5 min内每只大鼠进入3条臂的次数、顺序与停留时间[11]。

2 结果

2.1 抑郁样行为模型大鼠的行为学表现及空间学习记忆能力的变化

2.1.1 大鼠经CUS刺激后的行为学表现 与正常组相比，抑郁组与越鞠丸组的体质量[抑郁组与越鞠丸组(243.09±16.99)g，正常组(385.14±20.63)g，t=19.298，P=0.000]、糖水偏爱率[抑郁组与越鞠丸组(0.70±0.24)%，正常组(0.87±0.05)%，t=2.077，P=0.048]、旷场实验总得分(抑郁组与越鞠丸组43.32±23.07，正常组76.89±13.22，t=4.037，P=0.000)均有下降，显示造模成功。

2.1.2 大鼠经CUS刺激后空间学习记忆能力的变化 在Y迷宫实验中，抑郁组、越鞠丸组与正常组相比，自主交替率降低[抑郁组与越鞠丸组(0.10±0.11)%，正常组(0.26±0.14)%，t=3.433，P=0.002]、新异臂停留时间缩短[抑郁组与越鞠丸组(93.58±48.21)s，正常组(189.78±68.36)s，t=3.798，P=0.003]，新异臂潜伏期延长[抑郁组与越鞠丸组(13.68±7.33)s，正常组(7.00±4.72)s，t=2.903，P=0.008]，说明慢性应激刺激对大鼠的空间学习记忆能力造成损伤。

2.2 越鞠丸对抑郁样行为模型大鼠的行为学指标及空间学习记忆能力的影响

2.2.1 抑郁样行为模型大鼠给予越鞠丸21 d后行为学指标的变化 在旷场实验中，越鞠丸组(42.67±11.12)与正常组总得分(50.78±13.56)均高于抑郁组(30.20±10.42)(P<0.05)。抑郁组的体质量[(397.29±21.57)g]较正常组[(450.93±37.86)g]降低(P<0.05)，而3组在糖水偏爱率上差异无统计学意义(P>0.05)，说明越鞠丸有一定的抗抑郁作用(图1)。

2.2.2 给药后越鞠丸组大鼠空间学习记忆能力的变化

2.2.2.1 Y迷宫实验 越鞠丸组较抑郁组自主交替率[越鞠丸组(0.26±0.17)%，抑郁组(0.08±0.14)%、起始臂进入次数(越鞠丸组2.00±0.71，抑郁组1.00±0.82)和总进臂次数(越鞠丸组8.11±1.54，抑郁组5.80±2.66)均增加(P<0.05)。抑郁组较正常组自主交替率(0.29±0.14)%、起始臂进入次数(2.67±1.00)和总进臂次数(9.00±2.35)均降低(P<0.01)(图2)。

A.F=5.533，P=0.010；B.F=9.325，P=0.001；C.F=5.175，P=0.013。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.2.2.2 Morris水迷宫实验 在水迷宫空间探索阶段中，越鞠丸组较抑郁组目标象限停留时间延长[越鞠丸组(29.22±4.49)s，抑郁组(24.50±4.20)s，P<0.05]，穿越虚拟平台次数增加(越鞠丸组6.56±1.33，抑郁组4.30±0.95)(P<0.01)，显示越鞠丸对抑郁模型大鼠的记忆能力具有改善作用(图3)。

A.F=5.220，P=0.013；B.F=9.124，P=0.001。*P<0.05.**P<0.01。

3 讨论

CUS可较好地复制抑郁症的发病诱因[12]，尤其是环境因素，该模型动物的行为表现符合抑郁症患者的核心症状[13]，同时模型可维持3个月，是一种理想可靠的造模方法[14]，因此本研究采用该方法制备抑郁模型，并使用旷场实验和糖水偏爱实验两项行为学测试鉴定造模是否成功。本研究结果显示，和正常组大鼠相比，抑郁组与越鞠丸组在旷场中总活动次数减少，与抑郁症患者动作迟缓的症状相似，摄入糖水量的降低体现了兴趣减退的特征[13]，同时伴有体质量明显下降，显示造模成功。越鞠丸在临床上具有明显的抗抑郁疗效[4]，实验中灌胃给药21 d后的越鞠丸组旷场总得分高于抑郁组，表明越鞠丸能改善CUS所致抑郁大鼠的抑郁样行为症状[5]，这可能依赖于越鞠丸能够激活PKA-CREB信号通路使新生神经元数量增加以达到抗抑郁的效果[15]。

抑郁症的发生常伴随着认知功能障碍的出现，其中学习记忆的损伤更为明显[16]。慢性应激会导致大鼠产生学习记忆方面的损伤[17]，包括空间学习记忆、工作记忆等。Y迷宫是用于观察大鼠空间记忆能力的常见手段[18]。本研究结果显示，造模后抑郁组与越鞠丸组自主交替率、新异臂停留时间较正常组均减少，新异臂潜伏期延长，说明CUS刺激对大鼠的空间学习记忆功能造成了损伤。给药后越鞠丸组大鼠在Y迷宫测试中的自主交替率、起始臂进入次数与总进臂次数均增加，说明越鞠丸可以缓解应激导致的空间学习记忆障碍，与其他研究[5,19]中发现越鞠丸可以改善学习记忆损伤的作用结果一致。

Morris水迷宫实验是一种经典的评价动物空间学习记忆功能的方法[18]。本研究结果显示，越鞠丸使抑郁样行为模型大鼠在空间探索阶段中穿越虚拟平台次数增加、目标象限停留时间延长，说明越鞠丸增强了抑郁样行为模型大鼠的空间记忆能力。

综上所述,本研究发现越鞠丸在改善CUS大鼠抑郁样行为的同时也改善了应激导致的抑郁模型大鼠学习记忆的损伤，提示处理抑郁情绪与学习记忆能力的神经环路有交叉共享的可能，为未来研究治疗学习记忆障碍的抗抑郁中药提供了实验依据。