CircRNA_000809通过miR-200c-3p对子宫内膜异位症间质细胞的增殖、迁移及上皮间质转化的影响

徐超逸，陈海燕，陈赛玲，张铭瑶，梁宗文，段萍

1.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 妇产科，浙江 温州 325027；2.哈尔滨医科大学附属第二医院 妇产科，黑龙江 哈尔滨 150086

子宫内膜异位症的特征是有活性的子宫内膜样组织种植在子宫体以外的部位[1]，引起盆腔包块、进行性加重的痛经、性交痛以及不孕等[2]。有10%～15%的育龄期女性受其困扰[3]，但目前其发病机制尚不明确[4]。环状RNA（circularRNAs,circRNA）是一类广泛存在于真核细胞内，且具有调控基因表达作用的内源性非编码RNA[5-6]。根据竞争性内源性RNA理论，circRNAs可以作为内源性分子海绵与微小RNAs（miRNAs）竞争性结合，调控靶mRNA表达[7]。本课题组前期研究结果表明miR-200c-3p可以抑制异位子宫内膜间质细胞（ectopic endometrial stromal cells,EESCs）增殖及迁移能力[8]。本研究进一步利用基因芯片筛选出与miR-200c-3p相互作用的circRNAs。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示circRNA_000809在子宫内膜异位症组织中表达上调，miR-200c-3p表达下调；同时靶基因预测显示miR-200c-3p与circRNA_000809存在结合位点，且在子宫内膜异位症组织中miR-200c-3p与circRNA_000809的表达量呈负相关。敲低circRNA_000809引起的EESCs增殖、迁移能力及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白ZEB1/ZEB2的表达下降，可以一定程度被miR-200c-3pinhibitor逆转。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 临床标本：收集2020年1月至2022年1月于温州医科大学附属第二医院育英儿童医院行卵巢囊肿剥除术患者的卵巢巧克力囊肿组织25例，设为子宫内膜异位症组；收集25例因早期宫颈癌行子宫切除术或者行宫腔镜检查的育龄期非子宫内膜异位症患者的子宫内膜组织，设为正常子宫内膜组。纳入研究的25例子宫内膜异位症组年龄为25～39（32.0±3.1）岁，25例正常内膜组年龄为26～41（32.5±3.1）岁，差异无统计学意义（P＞0.05）。所有患者的月经周期正常，并且至少在6个月内没有性激素药物治疗。所有的组织样品均在温州医科大学附属第二医院育英儿童医院手术时收集，将标本快速储存到液氮中以备后用。本研究已获得温州医科大学附属第二医院医学伦理委员会的批准（编号：LCKY2020-88），患者均签署知情同意书。

1.1.2 试剂：Lipofectamine3000购自杭州禹扬科技有限公司；si-NC、si-circRNA_000809、inhibitor NC与miR-200c-3p inhibitor购自广州锐博生物公司；TRIzol试剂购自杭州禹扬科技有限公司；反转录试剂购自日本东洋纺公司；qRT-PCR试剂购自美国Thermo Fisher公司；EdU试剂盒购自上海碧云天科技有限公司；兔抗人ZEB1、ZEB2和Vimentin抗体购自武汉三鹰科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和qRT-PCR：使用TRIzol试剂从冷冻组织的异位子宫内膜和正常子宫内膜中提取总RNA，并用200 mL无核酸酶的水洗脱，NanoDrop ND-1000分光光度计检测RNA浓度，样品在260 nm/280 nm的吸光度比要求在1.8～2.0间。取1.0 μg总RNA于反转录试剂盒中进行反转录反应。将反转录产物在PCR扩增仪中进行扩增，反应条件为94 ℃、10 min预变性；95 ℃、30 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s，循环40次。以小核RNA（snRNA）U6作为内参，使用2-△△Ct方法计算目的基因的相对表达水平。

1.2.2 人EESCs的原代培养：人EESCs的提取参照文献[9-10]。用含2%青霉素-链霉素的枸橼酸盐缓冲液（PBS）冲洗异位子宫内膜组织，然后将其切成约1 mm3的碎片，并在胶原酶IV（5 mg/mL，15 U/mg）溶液中水浴消化1 h。通过400目的过滤器（美国纽约Falcon公司）分离EESCs，并用含10%胎牛血清（FBS）和1%双抗的DMEM培养基悬浮EESCs。将细胞置入75 cm2的细胞培养瓶中，在含5% CO2的37 ℃的恒温恒湿培养箱中进行培养。利用波形蛋白（vimentin）的免疫荧光化学染色进行细胞纯度鉴定。

1.2.3 细胞转染：si-NC、si-circRNA_000809、inhibitor NC与miR-200c-3pinhibitor均使用Lipofectamine 3000作为脂质体进行转染。inhibitor NC与miR-200c-3pinhibitor的浓度为100 nmoL/L，si-NC与si-circRNA_000809的浓度为50 nmoL/L。siNC（小干扰RNA阴性对照）+inhibitor NC（核酸抑制剂阴性对照），si-circRNA_000809（circRNA_000809小干扰RNA）+inhibitor NC和si-circRNA_000809+miR-200c-3pinhibitor（miR-200c-3p核酸抑制剂）。

1.2.4 细胞增殖能力测定：先将EESCs在无血清培养基中饥饿24 h。转染24 h后使用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（EdU）分析试剂盒检测细胞增殖能力。通过将EdU阳性细胞的数量除以DAPI染色的细胞总数，可以计算出EdU阳性细胞的百分比。所有实验需进行至少3次。

1.2.5 Transwell实验检测细胞迁移能力：取各组转染24 h的EESCs，悬浮在200 μL DMEM中加至上层小室，将含有10%胎牛血清的培养液加700 μL至下层小室，继续培养36 h，多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，应用显微镜测量迁移细胞数。

1.2.6 蛋白质印迹（Western blot）法：以含有1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液100 μL提取转染48 h的EESCs总蛋白，吸取蛋白样品20 μg进行SDS-PAGE电泳，并用300 mA的电流将蛋白转移至PVDF膜，快速封闭液封闭15 min后，分别于4 ℃孵育一抗稀释液（兔抗人ZEB1、ZEB2及ACTB抗体，均为1:500）18 h，于室温孵育二抗稀释液（HRP标记的山羊抗兔二抗，1:3 000）1 h，在ECL中显影，采用ImageJ软件分析各条带相对于内参ACTB的灰度值之比。

1.3 统计学处理方法 采用Graphpad Prism 7.0软件进行统计学分析。计量资料用表示。2组间比较采用独立样本t检验。多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。相关性采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组子宫内膜组织中circRNA_000809表达比较circRNA_000809在异位子宫内膜组的表达水平较正常子宫内膜组高，差异有统计学意义（P＜0.001），见图1。

图1 qRT-PCR检测circRNA_000809在正常子宫内膜组织和异位子宫内膜组织中的表达水平

2.2 EESCs中circRNA_000809与miR-200c-3p相关性分析 qRT-PCR结果显示，与正常内膜组织比，miR-200c-3p在异位内膜组织中表达下调，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2A。StarBase软件预测，circRNA_000809与miR-200c-3p间存在结合位点，见图2B。circRNA_000809和miR-200c-3p相关性分析显示，EESCs中两者表达呈负相关（r=-0.56，P=0.03），见图2C。为证实circRNA_000809与miR-200c-3p间调控关系，用si-circRNA_000809（circRNA_000809小干扰RNA）转染EESCs，结果显示敲低circRNA_000809可以上调miR-200c-3p的表达水平，差异有统计学意义（t=19.32，P＜0.05），见图2D。

图2 EESCs中circRNA_000809与miR-200c-3p相关性分析

2.3 敲低circRNA_000809对EESCs增殖能力的影响 分别用siNC+inhibitor NC、si-circRNA_000809+inhibitor NC和si-circRNA_000809+miR-200c-3pinhibitor共转染EESCs。与siNC+inhibitor NC组比，si-circRNA_000809+inhibitor NC组EESCs增殖能力减弱，而si-circRNA_000809+miR-200c-3pinhibitor组EESCs增殖能力较si-circRNA_000809+inhibitor NC组高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3A和图3B。这表明miR-200c-3pinhibitor使EESCs增殖能力一定程度回升，敲低circRNA_000809通过下调miR-200c-3p表达逆转EESCs增殖能力。

图3 敲低circRNA_000809对EESCs增殖能力的影响

2.4 敲低circRNA_000809对EESCs迁移能力的影响 与siNC+inhibitor NC组比，si-circRNA_000809+inhibitor NC组EESCs迁移能力减弱，而si-circRNA_000809+miR-200c-3pinhibitor组与si-circRNA_000809+inhibitor NC组比EESCs迁移能力增强，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4A和图4B。敲低circRNA_000809通过下调miR-200c-3p表达逆转EESCs迁移能力。

图4 敲低circRNA_000809对EESCs迁移能力的影响

2.5 敲低circRNA_000809对ZEB1/ZEB2蛋白表达的影响 与siNC+inhibitor NC组比，si-circRNA_000809+inhibitor NC组ZEB1/ZEB2蛋白水平显著下调，而si-circRNA_000809+miR-200c-3pinhibitor组ZEB1/ZEB2蛋白水平较si-circRNA_000809+inhibitor NC组高，差异有统计学意义（P＜0.05）见图5A-C。敲低circRNA_000809通过下调miR-200c-3p表达逆转EESCs ZEB1/2蛋白表达水平。

图5 敲低circRNA_000809对ZEB1/2蛋白表达水平的影响

3 讨论

子宫内膜异位症指有活性的子宫内膜组织生长在子宫体以外的部位，常见于卵巢、子宫骶韧带以及子宫直肠陷凹，引起盆腔包块、进行性加重的痛经、性交痛以及不孕等，严重影响患者身心健康及生活质量[11-12]。子宫内膜异位症的发病率呈逐渐上升趋势，在育龄期女性中发病率为10%～15%，在不孕患者中发病率高达30%～50%，给患者带来了巨大的经济负担[13-14]。但其发病机制仍不清楚，目前主要包括一些理论学说，经血逆流学说，体腔上皮化生学说，淋巴、血行转移及炎症免疫学说等[15]，但这些学说均不能完全解释子宫内膜异位症的发病机制，因此探讨其发病机制是当前子宫内膜异位症的研究热点。

非编码RNA，如circRNA和miRNA是无蛋白编码能力的功能性RNA分子。circRNAs结构上以共价闭合环的形式替代了5’末端帽子和3’末端的多聚腺苷酸尾结构[6]。随着相关研究的深入，越来越多的证据表明circRNAs参与了多种疾病的发生、发展，而且circRNAs可作为miRNAs的内源竞争性RNA（competing endogenouse,ceRNA）参与子宫内膜异位症的发生及发展过程[16]。下调circ_0000673通过miR-616-3p/PTEN轴促进子宫内膜异位症细胞增殖和迁移[17]。circZFPM2通过调控miR-205-5p/ZEB1信号通路促进子宫内膜异位症EMT[18]。miR-200c-3p是一个良好的抑癌基因[19]，且前期研究结果表明miR-200c-3p可以抑制EESCs的众多表型，但是在子宫内膜异位症中尚未见报道内源性竞争miR-200c-3p从而共同调控子宫内膜异位症进程的circRNAs。

本研究利用生物信息学分析发现circRNA_000809与miR-200c存在结合位点，且用qRT-PCR实验检测到，与正常内膜组织相比，circRNA_000809在异位内膜组织中呈高表达，提示circRNA_000809可能在子宫内膜异位症的发生过程中发挥重要调控作用。进一步研究发现敲低circRNA_000809后miR-200c-3p的表达量上调。miR-200c-3p在子宫内膜异位症中呈低表达，相关性分析表明circRNA_000809与miR-200c-3p在子宫内膜异位症中的表达量呈负相关。以上结果说明，circRNA_000809可作为miR-200c-3p的ceRNA参与子宫内膜异位症的发生发展。利用回复实验对该结论进行了验证，其结果也表明敲低circRNA_000809对EESCs增殖能力及迁移能力的抑制，可以通过共转染miR-200c-3pinhibitor得到逆转，进一步说明circRNA_000809与miR-200c-3p的相互作用可以调控子宫内膜异位症进程。

研究表明，EMT在子宫内膜异位症的发生和发展中起着重要的作用。EMT参与了子宫内膜异位症局部病灶的形成，局部炎症的损伤、修复和纤维化过程[20]。EMT相关蛋白ZEB1和ZEB2是miR-200c-3p已知的靶基因[19]。本研究发现敲低circRNA_000809可以抑制EMT相关蛋白ZEB1/ZEB2的表达，并可以被miR-200c-3p在一定程度上逆转。这些结果表明circRNA_000809通过作用于miR-200c-3p调控ZEB1/ZEB2的表达，进而调控EMT的进展，从而影响子宫内膜异位症的发生发展。

综上所述，circRNA_000809在子宫内膜异位症中表达水平升高，而miR-200c-3p的表达水平降低。circRNA_000809通过ceRNA机制调控miR-200c-3p，进而调控EESCs的增殖、迁移及EMT相关蛋白ZEB1/ZEB2的表达。circRNA_000809/miR-200c-3p/EMT轴可能成为子宫内膜异位症分子治疗的潜在靶点。