响应面法优化虾青素-植物甾醇亚麻酸酯复合脂质体的制备工艺

张 新，潘 丽*，常振刚，郭晓引，李雪琴*

1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001 2.河南金谷实业发展有限公司，河南 郑州 450003

虾青素是一种广泛存在于自然界中的天然类胡萝卜素，具有抗炎[1]、抗氧化[2]以及增强免疫力[3]等多种生理功能，但其具有水溶性低、稳定性差等[4]特点，故生物利用率不高，在实际应用中受到较多限制。为了提高虾青素的水溶性、稳定性以及生物利用率，研究者采用多种手段将其包埋，脂质体是常用的方法之一[5-6]。

脂质体是一种类似于细胞膜的闭合囊泡状结构，对包埋的功能因子具有运转、保护、靶向和缓释等作用[7-8]。目前通常以胆固醇来稳定脂质体膜[9-12]，但摄入过多的胆固醇会引起心脑血管疾病、动脉粥样硬化等多种健康问题[13-14]。植物甾醇具有抗癌、抗炎以及降低胆固醇等多种生理功能，其结构与胆固醇相似，同样可以对脂质体膜的稳定性进行干预，研究发现以植物甾醇取代胆固醇构建的脂质体既可以避免胆固醇的负面效应，还能调控脂质体稳定性[15-18]，但植物甾醇不溶于水，在油相中的溶解度也不高，不易被人体消化利用，而且熔点较高，从而限制了它的应用范围[19]。植物甾醇酯是由植物甾醇和脂肪酸通过酯化反应制得，兼具植物甾醇和脂肪酸多重生理功效，并且脂溶性也得到了提高[20-21]。将植物甾醇酯代替胆固醇应用到负载脂溶性生物活性物质的脂质体构建中的研究尚未见报道。作者以大豆磷脂为主要膜材，运用薄膜-超声法构建虾青素-植物甾醇亚麻酸酯复合脂质体，优化制备复合脂质体的最佳工艺条件，探讨利用脂质体同时运载多种生物活性物质的可行性，为新型运载体系的研究开发提供技术手段和新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大豆磷脂(纯度98%)：沈阳天峰生物制药有限公司；虾青素(纯度98%)：上海研域商贸有限公司；植物甾醇亚麻酸酯(纯度96%)：实验室自制；三氯甲烷、石油醚(沸程30～60 ℃)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司；吐温80：化学纯，天津市鼎盛鑫化工有限公司。

1.2 仪器与设备

AUY120电子分析天平：岛津国际贸易(上海)有限公司；RE-52AA旋转蒸发器、SHZ-Ⅲ循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂；JY92-IIN超声乳化分散器：宁波新芝生物科技股份有限公司；TG16-WS高速台式离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 复合脂质体的制备

采用薄膜-超声法[22]：称取200 mg磷脂和一定量的植物甾醇亚麻酸酯、虾青素，加三氯甲烷溶解。50 ℃避光旋蒸除去三氯甲烷，然后加入含有吐温80的磷酸盐缓冲液(PBS)进行洗膜，使其形成脂质体混悬液，并于冰水浴中探针式超声4 min(180 W，开5 s，关5 s)，得到虾青素-植物甾醇亚麻酸酯复合脂质体。

1.3.2 虾青素标准曲线的建立

准确称取1.0 mg 虾青素标准品，加三氯甲烷溶解并转移至100 mL容量瓶中定容。用移液管分别移取1、2、3、4、5、6 mL虾青素标准溶液并稀释至25 mL，配制一系列梯度浓度的虾青素溶液，在虾青素溶液最大吸收波长(492 nm)处分别测定吸光度。以虾青素浓度为x轴，吸光度为y轴绘制标准工作曲线，标准曲线方程为y=0.140 3x-0.000 9,R2=0.999 9。

1.3.3 虾青素包封率的测定

准确移取一定量的虾青素-植物甾醇亚麻酸酯复合脂质体于50 mL圆底烧瓶内，加入适量石油醚并于30 ℃水浴搅拌，萃取游离虾青素。10 min后进行离心，并吸取上清液。重复上述步骤至上清液澄清，合并上清液后旋蒸除去石油醚，用三氯甲烷定容至10 mL容量瓶中，于492 nm处测定吸光度。

1.3.4 单因素试验

以包封率为考察指标，分别研究植物甾醇亚麻酸酯与磷脂质量比(5%、10%、15%、20%、25%)、吐温80用量(40、60、80、100、120 mg)、PBS的pH值(6.2、6.6、7.0、7.4、7.8)、水相与有机相体积比(2/1、3/1、4/1、5/1、6/1)以及磷脂与虾青素质量比(40/1、50/1、60/1、70/1、80/1)对复合脂质体包封率的影响。

1.3.5 响应面优化试验

在单因素试验基础上，依据Box-Behnken中心组合设计原理，以复合脂质体的包封率为响应值，选择合适的因素与水平设计响应面优化试验，确定最佳制备工艺。

1.4 数据处理与分析

所有试验至少重复3次，结果取平均值，采用Origin 8作图，采用SPSS 23进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 植物甾醇亚麻酸酯与磷脂质量比对复合脂质体包封率的影响

在制备脂质体过程中加入一定量的膜调节剂能够改善脂质双分子层结构的特性，提高脂质体的稳定性[23]。固定PBS的pH值为7.4，水相与有机相体积比5/1，吐温80用量100 mg，磷脂与虾青素质量比50/1，考察植物甾醇亚麻酸酯与磷脂质量比对包封率的影响。由图1可知，随着植物甾醇亚麻酸酯与磷脂的质量比的增大，脂质体的包封率先增高后降低。在植物甾醇亚麻酸酯与磷脂质量比为10%时，包封率最大，为(95.32±0.11)%。适量的植物甾醇亚麻酸酯可与磷脂相互作用，使脂质膜结构更紧密，芯材不易泄露，从而提高虾青素的包封率[24]。当植物甾醇亚麻酸酯过量时，可能占据了囊泡一定的空间，使得包封率下降。

图1 植物甾醇亚麻酸酯与磷脂质量比对 复合脂质体包封率的影响Fig.1 Effect of the mass ratio of phytosterol linolenic acid ester to phospholipids on the encapsulation efficiency of complex liposomes

2.1.2 PBS的pH值对复合脂质体包封率的影响

固定其他条件，考察PBS的pH值对复合脂质体包封率的影响。由图2可知，随着PBS 的pH值的增大，包封率先升高而后又降低，在pH 7.4时达到最大,为(95.12±0.45)%。随着pH值继续增大，包封率降低。原因可能是在强酸或强碱环境下，磷脂的水解常数增大而发生水解，脂质体囊泡遭到破坏，导致芯材渗漏，而在pH 7.4时，酸碱性适宜，有利于脂质体稳定[25]。

图2 pH值对复合脂质体包封率的影响Fig.2 Effect of pH value on the encapsulation efficiency of complex liposomes

2.1.3 水相与有机相体积比对复合脂质体包封率的影响

固定其他条件，考察水相与有机相的体积比对包封率的影响。由图3可知，当水相与有机相体积比增大时，复合脂质体的包封率也随之增大，在体积比为4/1时，复合脂质体的包封率达到最大，为(94.28±0.04)%，之后随着水相与有机相体积比的增大，包封率呈现下降趋势。这可能是因为有机相的量过小时，不能完全将磷脂等膜材全部溶解，导致包封率不高；而大量的有机相存在时，不利于脂质体囊泡的形成，使包封率降低[26]。

图3 水相与有机相体积比对复合脂 质体包封率的影响Fig.3 Effect of the volume ratio of water phase to organic phase on the encapsulation efficiency of complex liposomes

2.1.4 吐温80用量对复合脂质体包封率的影响

固定其他条件，考察吐温80用量对复合脂质体包封率的影响。由图4可知，随着吐温80用量的增多，复合脂质体包封率也逐渐上升，当用量为100 mg时包封率达到最大，为(94.41±0.10)%，之后随着吐温80用量的持续增多，包封率出现下降趋势。作为表面活性剂，吐温80能够影响磷脂分子两端的运动，适量的加入可以平衡脂质体膜的表面张力，使芯材不易渗漏[27]。吐温80用量从40 mg增至120 mg时，包封率为91.61%～94.41%，与其他因素相比，变化范围较小，表明吐温80用量对包封率的影响相对较小。

图4 吐温80的用量对复合脂质体 包封率的影响Fig.4 Effect of Tween 80 dosage on the encapsulation efficiency of complex liposomes

2.1.5 磷脂与虾青素质量比对复合脂质体包封率的影响

虾青素为亲脂性物质，可通过将其包埋于脂质体中从而提高虾青素的水分散性[22]，因此，膜材与芯材的质量比直接影响脂质体的包封率。固定其他条件，考察磷脂与虾青素的质量比对复合脂质体包封率的影响。由图5可知，当磷脂与虾青素质量比增大时，复合脂质体包封率也逐渐增大，当质量比为50/1时，复合脂质体的包封率达最大，为(93.37±0.03)%，随着质量比继续增加，包封率开始下降。对脂质体囊泡来说，在有限的空间内，虾青素的量适量增加，脂质体的包封率增大。当囊泡的空间达到饱和后，虾青素将游离在脂质体囊泡外，导致包封率下降。磷脂与虾青素质量比从40/1增至80/1时，包封率为90.59%～93.37%，与其他因素相比，变化范围较小，表明磷脂与虾青素质量比对包封率的影响相对较小。

图5 磷脂与虾青素质量比对复合脂质体 包封率的影响Fig.5 Effect of the mass ratio of phospholipids to astaxanthin on the encapsulation efficiency of complex liposomes

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面设计及分析

在单因素试验基础上，以复合脂质体的包封率作为响应值(Y)，选取对包封率影响较大的3个因素，即植物甾醇亚麻酸酯与磷脂质量比、PBS的pH值以及水相与有机相体积比作为自变量，进行响应面优化试验,因素与水平见表1。设计方案及结果见表2。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface design

表2 响应面设计及结果Table 2 Design and results of response surface

2.2.2 响应面交互作用分析

交互作用的强弱一般可通过等高线的形状直接进行分析，若两因素交互作用显著，则等高线呈椭圆形，若两因素交互作用不显著则等高线偏圆形。由图6a可知，当水相与有机相体积比不变时，随着植物甾醇亚麻酸酯与磷脂质量比和PBS的pH值增加，包封率先升高后降低，等高线为椭圆形，说明植物甾醇亚麻酸酯与磷脂质量比和PBS的pH值之间的交互作用显著。由图6b可知，当PBS的pH值不变时，随着植物甾醇亚麻酸酯与磷脂质量比和水相与有机相体积比的增加，包封率先升高后降低，等高线为椭圆形，说明植物甾醇亚麻酸酯与磷脂质量比和水相与有机相体积比之间的交互作用显著。由图6c可知，当植物甾醇亚麻酸酯与磷脂质量比不变时，随着PBS的pH值和水相与有机相体积比增大，包封率先升高后降低，等高线偏圆形，说明PBS的pH值和水相与有机相体积比之间的交互作用较弱。

表3 响应面模型的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface model

图6 各因素交互作用对包封率影响的响应曲面Fig.6 Response surface of the effects of each factor interactions on encapsulation efficiency

2.2.3 验证试验

由Design-Expert 8.0.6软件进行综合性分析，得出制备复合脂质体的最优工艺条件：植物甾醇亚麻酸酯与磷脂质量比11.3%、PBS的pH值7.44、水相与有机相体积比3.8/1，此时，复合脂质体的理论包封率为96.29%。综合各种因素，最终设定制备复合脂质体的最优工艺条件：植物甾醇亚麻酸酯与磷脂质量比10%(磷脂200 mg)、PBS的pH值7.4、水相与有机相体积比4/1、吐温80用量100 mg、磷脂与虾青素质量比50/1，经3次重复试验测得设定条件下制备的复合脂质体的包封率为(95.87±0.40)%，与理论包封率相接近，表明该模型的预测效果良好。

3 结论

通过单因素试验考察植物甾醇亚麻酸酯与磷脂的质量比、吐温80的用量、PBS的pH值、水相与有机相的体积比以及磷脂与虾青素质量比对复合脂质体包封率的影响。进行响应面优化试验，方差分析显示模型拟合程度高，试验结果可信。最终确定制备复合脂质体的最优工艺条件：植物甾醇亚麻酸酯与磷脂质量比10%(磷脂200 mg)、PBS的pH值7.4、吐温80用量100 mg、水相与有机相体积比4/1、磷脂与虾青素质量比50/1。在最优工艺条件下制得的复合脂质体包封率为(95.87±0.40)%，与理论值较为接近，表明模型的预测效果良好，适用于复合脂质体制备工艺参数的优化。