二次双溶剂冷冻结晶法分离纯化橡胶籽油中α—亚麻酸的研究

雍梁敏+刘石生

摘 要：以橡胶籽油为原材料，皂化得混合脂肪酸，经冷冻结晶得脂肪酸Ⅰ，最佳条件是通过低温结晶法从纯双橡胶溶剂中分离α-亚麻酸的响应面方法建立的。基于单因素实验，乙腈和丙酮/脂肪酸Ⅰ（v/m），乙腈/丙酮（v/ v），冷冻时间三因素，运用中心组合实验设计，考察了三因素之间相互作用。借助响应面法分析实验数据，结果表明：以乙腈和丙酮为混合溶剂，乙腈与丙酮/脂肪酸Ⅰ（v/m）为18：1，乙腈/丙酮（v/v）为1.5：1，冷冻时间为9h，固液分离方式为-18℃、7000r/min冷冻离心3min，橡胶籽油中α-亚麻酸含量最高达45.41%。与传统方法相比，此法提纯效率高，脂肪酸不易氧化，为α-亚麻酸的纯化提供了一种新的方法。

关键词：橡胶籽油；二次双溶剂冷冻结晶法；α-亚麻酸；纯化

α-亚麻酸（18：3n-3）属ω-3系列多烯脂肪酸，是构成人体组织细胞的主要成分，机体不能合成、代谢，经转化可得人体必需的活性物质DHA和EPA[1]。α-亚麻酸不仅具有降低血脂、血压、血糖，抑制癌症发生与转移，抑制过敏反应，抑制衰老，抗炎，提高记忆力，还可用于治疗和预防心脑血管病痴呆症等疾病[2]。因此，开发利用天然的α-亚麻酸具有广泛的医疗应用前景。虽然改变溶剂对冷冻结晶效果较明显，但很少有人研究冷冻结晶次数对产物纯度的影响，本文通过增加冷冻结晶次数分离橡胶籽油中α-亚麻酸，了解了α-亚麻酸（ALA）、亚油酸（LA）和油酸（OA）在冷冻结晶过程中变化，考察了乙腈/丙酮、乙腈与丙酮/脂肪酸Ⅰ、冷冻时间对二次分离效果的影响，通过响应面分析得到最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

橡胶籽油：采用有机溶剂提取法从橡胶籽中提取；脂肪酸Ⅰ：混合脂肪酸经冷冻结晶预处理所得产物；脂肪酸Ⅱ：双溶剂冷冻结晶法所得产物；脂肪酸Ⅲ：二次双溶剂冷冻结晶法所得产物；丙酮、乙腈等试剂均为国产分析纯。

電子天平：EL303（0.001g），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；旋转蒸发仪：RE-52系列，上海亚荣生化仪器厂；pH计：PHS-3C，上海精密科学仪器有限公司；冷冻高速离心机：设备型号为UNIVERSAL 32R，德国Hettich；超低温冰箱：Thermo Electron Corporation；Agilent 7890A GC：美国Agilent公司。

1.2 混合脂肪酸的制备

采用皂化法制备混合脂肪酸（FFA）。

1.3 脂肪酸Ⅰ的制备

采用冷冻结晶法制备脂肪酸Ⅰ。

1.4 脂肪酸Ⅱ的制备

采用双溶剂冷冻结晶法制备脂肪酸Ⅱ。

2 实验分析与结果

2.1 单因素试验

选取乙腈与丙酮溶剂/脂肪酸Ⅰ（v/m）、乙腈/丙酮（v/v）、冷冻时间三个因素对α-亚麻酸提纯率的影响进行单因素试验，以确定最佳提取条件。

亚油酸和油酸含量随着溶剂量的增加而降低，α-亚麻酸含量随着溶剂量的增加而增加。当乙腈和丙酮溶剂/脂肪酸Ⅰ（v/m）为20：1时，达到最大，亚油酸含量和油酸含量最小。当乙腈和丙酮溶剂的量不断增加时，由于乙腈在-75℃会凝固，晶体逐渐升高，母液容易包裹在晶体孔结构中，导致母液和晶体难以完全分离，α-亚麻酸含量也随之下降。因此，乙腈与丙酮溶剂/脂肪酸I（v/m）的最佳比例为20：1。设定乙腈/丙酮（v/v）为1.5：1，冷冻时间为10h，考察不同乙腈与丙酮溶剂/脂肪酸Ⅰ（v/m）对分离效果的影响，亚油酸和油酸含量逐渐降低，α-亚麻酸含量随溶剂用量的增加而增加。当乙腈和丙酮溶剂/脂肪酸Ⅰ（v/m）为20：1时，亚油酸纯度达到最大，亚油酸含量和油酸含量降至最低。当乙腈和丙酮溶剂的量增加时，由于乙腈在-75℃会凝固，晶体逐渐升高，母液容易包裹在晶体孔结构中，导致母液和晶体难以完全分离，α-亚麻酸含量则有所下降。

2.2 响应面法实验设计

2.2.1 响应面回归模型的建立

利用Design-Expert软件对表2数据进行多元回归拟合，得到相应的模型为：

Y=45.20-1.55X1-1.17X2-0.086X3-1.67X1X2- 1.05X1X3+2.43X2X3-1.68X12-5.75X22-3.61X32

Y为α-亚麻酸的含量，%；

X1为乙腈与丙酮/脂肪酸Ⅰ；

X2为乙腈/丙酮；

X3为冷冻时间，h。

2.2.2 验证试验

α-亚麻酸的最佳分离条件如下：乙腈和丙酮/脂肪酸Ⅰ分别为17.68：1（v/m），乙腈/丙酮为1.49（v/v），冷冻时间为9.05h，α-亚麻酸含量为45.57%。丙酮和丙酮/脂肪酸Ⅰ分离α-亚麻酸与橡胶籽油的最佳条件为18：1（v/m），乙腈/丙酮为1.5：1（v/v），冷冻时间为9小时

在此工艺条件下进行3组平行试验，得到α-亚麻酸含量平均值为45.41%，与理论值相差0.16%.因此，本模型可以较好地反映二次冷冻结晶分离橡胶籽油的最佳工艺条件。

3 结果与讨论

3.1 经不同分离纯化技术分离纯化前后橡胶籽油中脂肪酸相对含量变化

分析不同脂肪酸产品中脂肪酸相对含量，比较不同分离纯化工艺分离橡胶籽油中α-亚麻酸的效果。实验可知，混合脂肪酸油经冷冻结晶，饱和脂肪酸基本去除，脂肪酸Ⅰ中总不饱和脂肪酸含量达98.67 %，达到了预浓缩的目的。经不同分离方法处理所得的脂肪酸产品，分离纯化效果各不相同。从α-亚麻酸含量的角度分析，采用二次双溶剂冷冻结晶法效果最好，双溶剂冷冻结晶法次之，冷冻结晶法的分析效果最差。由此可知，冷冻结晶的原材料、溶剂的种类与数量和结晶次数对冷冻结晶分离α-亚麻酸效果影响较大。

3.2 经过处理的橡胶籽油中α-亚麻酸样品的得率

橡胶籽油经双溶剂冷冻结晶法、二次双溶剂冷冻结晶法提纯后，虽然产物中α-亚麻酸纯度都在31.52%～45.41%，但α-亚麻酸样品得率较低，只有10%～20%左右，说明橡胶籽油中α-亚麻酸在分离纯化过程中损失较多。为了提高α-亚麻酸样品得率，生产过程中建议对冷冻分离残渣进行二次分离纯化。由于采用双溶剂冷冻结晶法所得产品得率低，而经冷冻结晶法处理脂肪酸Ⅰ得率达68.49%[18]。所以本文采用经冷冻结晶法提纯的原材料作为二次双溶剂冷冻结晶的原材料。

4 结论

采用二次双溶剂冷冻结晶法分离纯化橡胶籽油中α-亚麻酸，通过单因素实验和Box-Behnken实验设计以及响应面分析对分离纯化工艺进行优化，得出最佳工艺条件为：以乙腈和丙酮为混合溶剂，乙腈与丙酮/脂肪酸Ⅰ（v/m）为18：1，乙腈/丙酮（v/v）为1.5：1，冷冻时间为9h，固液分离方式为-18℃、7000r/min冷冻离心3min。在该条件下，橡胶籽油中α-亚麻酸含量达45.41%。

对不同冷冻结晶分离纯化橡胶籽油中α-亚麻酸的分离效果进行研究发现：所得脂肪酸产品中α-亚麻酸含量次序为脂肪酸Ⅲ>脂肪酸Ⅱ>脂肪酸Ⅰ，说明二次冷冻结晶分离橡胶籽油中效果最好。

基金项目：国家自然科学基金（20866003）；海南大学中西部高等教育振兴计划资助。

参考文献

[1] 杨静，常蕊.α-亚麻酸的研究进展[J].农业工程，2011，1（1）：72-75.

[2] 李冀新，张超，罗小玲.α-亚麻酸研究进展[J].粮食与油脂，2006，（2）：10-12.

作者简介

雍梁敏（1989-），男，硕士研究生，研究方向为植物油脂

通讯作者：刘石生（1977-），男，教授，博士研究生，研究方向：热带农产品研究