富硒生物活性肽制备技术及其功能研究进展

黄继红，赵朋辉，侯银臣，陈文静，廖爱美，潘 龙，李彦瑾，杨盛茹，李 琰

1.河南工业大学 生物工程学院，小麦生物加工与营养功能河南省重点实验室，河南 郑州 450001 2.许昌学院 食品与药学院，河南 许昌 461000 3.河南大学 农学院，作物逆境适应与改良国家重点实验室，河南 开封 475004 4.河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450046

硒(Se)是人体必需的14种微量元素之一[1]，可抑制癌细胞的脱氧核糖核酸(DNA)合成，减缓肿瘤细胞的生长，在抵抗毒力发展和抑制艾滋病病毒(HIV)演变为艾滋病(AIDS)中扮演着重要角色[2]。适量的硒在提高人体免疫力、抗氧化、维持正常生理活动方面有着不可替代的作用[3]，缺乏会影响硒蛋白的表达及其生物学功能的发挥，从而导致大骨节病、心血管病、糖尿病、肝脏病等疾病的产生[4]。人体内不能自主合成硒，通过饮食摄入是补充、储存硒的唯一途径[5]。然而，无机硒的吸收利用率受食物来源、化学基质性质及不同形式硒的最佳营养水平等因素的影响，使得我国大部分地区人体内硒含量普遍偏低。因此，开发一种较好的硒补充剂成为研究的重点。富硒生物活性肽已被证实具有抵抗氧化损伤、神经保护的作用[6]，其有机硒含量与抗氧化活性呈正相关，可被用作功能性食品中的天然抗氧化剂[7]。硒生物强化玉米肽(SeCPs)对刀豆蛋白A(Con A)诱导的肝损伤小鼠起一定保护作用，这与富硒肽抗氧化能力和减少脂质过氧化、抑制TNFα和IFN-γ等免疫因子的释放有关[8]。此外，Fang等[9]从富硒大米蛋白水解物(SPHs)中筛选、分离、纯化得到具有免疫调节活性的含硒肽，并通过质谱鉴定及数据库比对确定SPHs的免疫调节活性与含硒肽结构中的SeMet序列相关。以上研究表明，富硒活性肽作为改善人类健康的功能性食品添加剂潜力巨大。

近年来随着人民不断增长的营养方面的需求，对富硒生物活性肽的研究正逐步深入展开，愈来愈多的研究指向生物活性以及代谢机制。作者对富硒生物活性肽的制备、生物活性及生物利用度等方面展开综述，并对研究中存在的问题加以讨论，以期能够为更深入探究富硒生物活性肽提供参考，并为其在未来医疗、食品等行业开发利用提供理论支撑。

1 富硒生物活性肽的来源

富硒生物活性肽根据来源不同可分为植物来源、微生物来源，最近几年也出现以生物合成、金属螯合制备富硒生物活性肽的报道。

1.1 植物来源

目前通过强化土壤中硒含量，生产富硒植物食品是改善硒缺乏状况的主要途径。植物来源的硒肽具有高亲核的硒氨基酸、特殊肽序列，所以生物利用度比无机硒高[10]。张驰等[11]研究发现富硒玉米中主要含硒组分为蛋白质硒，且在玉米不同营养成分中分布情况也有所不同，在非蛋白质与多糖中分布较少。王真真等[12]采用质谱法及高效液相色谱-等离子体质谱法对富硒玉米蛋白水解物中硒肽及含硒氨基酸的结构进行分析与鉴定，确定其中包含4种含硒氨基酸，分别为硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代乙硫氨酸(SeEt)、L-硒-甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代胱氨酸(SeCys2)。程天德[13]选用枯草杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解富硒大豆蛋白粉，通过石墨炉原子吸收分光光度法测得富硒大豆粉样中的硒含量为10.68 μg/g，经超滤分离得到分子质量1 000 Da以下的富硒大豆低聚肽。董蕾[14]采用多酶复合水解富硒大豆，得到具有防治铅中毒作用的富硒蛋白。Jaiswal等[15]发现富硒芥菜蛋白与黑素瘤细胞毒性和氧化应激水平有关，作用机制与谷胱甘肽过氧化物酶活性的显著增加有密不可分的联系。目前提取植物富硒生物活性肽的方法主要有水提法[16]、盐提法[17]、酸提法[18]、醇提法[19]、碱提法[20]、有机溶剂萃取法[21]、生物学方法[22-23]、柱分离技术[24]、辅助提取技术[25]等。

1.2 微生物来源

微生物来源富硒生物活性肽主要有两种方式：微生物转化法将无机态硒转化为结合态；酶解含硒蛋白。

酵母是目前发现的最佳有机硒富集载体，前人已经利用无机碲生长的酿酒酵母ATCC7752获得的总蛋白自溶来实现碲肽制备，证明利用微生物转化制备富硒肽的可行性[26]。Chen等[27]以亚硒酸钠为硒源，利用蜡样芽孢杆菌进行富硒发酵得到硒转化率为(94.3±0.2)%的富硒菌株。同样，陈里[28]对产朊假丝酵母进行选育，得到富硒酵母菌株，并对酵母硒蛋白进行酶解，对酶解物进一步分离纯化制备出富硒酵母低聚肽(分子质量1 300 Da 以下)。以上研究表明以富硒生物活性肽的形式提取有机硒是可行性的。

1.3 生物合成

植物、动物来源富硒生物活性肽的制备成本高且分离纯化难，目前基因组学、蛋白质组学研究不断深入，使得人工合成富硒生物活性肽取得了较大进展。人工合成富硒肽包括酶法、基因重组法、蛋白质修饰等。蛋白质的性质取决于结构，而多肽链的氨基酸序列是影响结构的决定因素。在翻译前将mRNA片段剪接或将特定氨基酸序列编码进蛋白质多肽链中合成目的蛋白在理论上是完全可行的。利用大肠杆菌中重组蛋白的同源表达来生产特定蛋白质是现代分子生物学常用方法，其mRNA包含特定序列，与UGA密码子相连后对翻译过程产生影响。这种合成方法效率远远超过内源性细菌硒蛋白的自然合成水平，然而，一些关键因素如插入序列元件兼容性、化学计量的干扰、UGA抑制等仍应注意[29]。邹险峰等[30]通过精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸( RGD)序列N-端引入硒代半胱氨酸(Sec)，设计出SecRGD序列模拟谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)，利用Fmoc固相合成法合成SecRGD。该富硒生物活性肽以SecRGD的二聚体形式存在，并证实其同样具有 GPX 活力和抗氧化活性。

1.4 金属螯合

以食源蛋白为原料合成的矿物质螯合肽，因其特殊的组装和吸收方式，使得在机体中可持续解离，且吸收率高、无毒害、稳定性好，具有潜在的药用价值。Baker等[31]研究发现小鼠摄入半胱氨酸、蛋氨酸会与其肠道内的硒元素螯合，改变硒为小分子硒螯合肽，极大降低硒的毒性。Ye等[32]将大豆分离蛋白肽(SPIPs)与硒螯合制备一种新型有机硒(SPIP-Se)，分子质量为180～3 000 Da，具有良好的溶解性，在螯合过程中，SPIP分子结构发生折叠和聚集。在体外，SPIP-Se比SPIP具有更强的羟自由基清除活性和还原能力。此外，SPIP-Se还能通过增强抗氧化酶的活性来修复H2O2诱导的Caco-2细胞氧化损伤。Doan等[33]分别用亚硒酸钠、大豆蛋白螯合硒、亚硒酵母对猪进行17 d饲喂，结果显示，螯合硒具有与有机硒相当的抗氧化作用。Zou等[34]在原有的具有GPX活性的15肽和17肽的基础上，设计合成一种新的32肽(32 P)，又将新肽与铜、硒螯合转化为新的含硒、铜的32-肽(Se-Cu-32P)，与之前相比，螯合后的新肽具有更好的超氧化物歧化酶(SOD)和GPX活性，抗氧化能力大幅提升。Davis等[35]调查中也提到南非姆普马兰加省地区人群采用口服蛋氨酸螯合硒补充剂可以改善硒缺乏状况。硒螯合肽安全性高、抗氧化能力强，可作为高效膳食有机硒补充剂在未来的食品或制药领域广泛应用。

2 富硒生物活性肽的生物活性

2.1 抗癌活性

富硒生物活性肽抗癌活性受Se状态的影响，有必要通过饮食干预减少患癌风险。在普通食品和富硒酵母中，硒化合物主要形式是硒代蛋氨酸(SeMet)，SeMet对博来霉素(BLM)诱导的脱氧核糖核酸有抗原毒性作用，且对这种损伤的修复和持续也有影响，并以此阻滞癌细胞的生长[36]。在人结肠癌细胞(HCT116)中，SeMet激活信号调节激酶(ERK)可导致组蛋白H3磷酸化，不同位点的磷酸化可能与破坏三维纤维结构，改变基因表达、有丝分裂时的细胞周期阻滞等有关，最终抑制癌细胞生长[37]。Goltyaev等[38]通过体外和体内研究发现甲基硒酸(MSA)对许多癌细胞具有强大的抗癌活性，并且具有剂量依赖性，7种ER-驻留硒蛋白在ER-胁迫下的基因表达水平与MSA浓度有关。富硒生物活性肽与癌症关系错综复杂，有待于运用蛋白质组学进行更深层次的研究[39]。

2.2 抗氧化活性

富硒生物活性肽在体内具有特定的组织分布且对硒水平变化较为敏感，是维持氧化还原稳态的抗氧化防御系统的重要组成部分，硒半胱氨酸残基是所有氧化还原酶类硒肽催化活性位点，作用机理与影响内质网(ER)氧化应激相关。目前发现具有抗氧化作用的富硒生物活性肽主要有GPX、硒蛋白P (SelP)、硒蛋白V(SelV)等。GPX可催化过氧化氢类物质还原为水或相应的醇[40]，减少磷脂氢过氧化物的聚集，从而使细胞质膜免受氧化应激造成的损伤。而GPX4被认为是铁下垂的中枢调节因子，参与降低细胞膜氧化脂肪酸和胆固醇含量[41]。SelP是唯一被鉴定的哺乳动物分泌蛋白，其表观天然分子质量约为60 kDa，研究发现SelP可作为一种肝因子影响腺胰岛素水平和高糖诱导的胰岛素分泌，抑制SelP的活性可改善糖代谢[42]。对胞外SelP保护肝氧化研究显示，SelP保护细胞质膜免受氧化损伤作用与谷胱甘肽有关[43]。Zhang等[44]发现SelV的过度表达可增强小鼠抗氧化防御能力和对促氧化剂诱导的ER应激信号和氧化损伤的抵抗力。ER参与一些重要生理蛋白的控制和折叠以维持稳态，此过程极易出现偏差，其结果导致活性氧增加，最终使细胞活性下降甚至程序性死亡[45]。事实上，ER应激促使内分泌和神经内分泌细胞的激素分泌受损，是人体众多疾病的罪魁祸首，如神经退行性疾病[46]、帕金森病[47]、癌症[48]等。硒蛋白T是硒蛋白家族中唯一的ER驻留硒蛋白，控制氧化还原和离子环境以维持蛋白质平衡，其结构或基因的改变将导致细胞凋亡[49]。基于ER应激途径靶点作为治疗途径也成为现代医学研究的重点。

2.3 抗病毒活性

病毒感染过程中会产生活性氧(ROS)，在低浓度下，ROS参与到细胞信号传递、增殖、肿瘤抑制和维持免疫系统等生理过程中并发挥积极作用，但一旦过量，就会突破抗氧化防御系统引起氧化应激[50]。氧化应激会促进核酸、蛋白质和脂质的损伤[51]，从而导致一系列的临床症状如人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV)等的产生[52]。研究发现ROS在此过程中不仅扮演着信号介质的角色，而且还参与T细胞活化和增殖[53]。Taylor等[54]的研究显示，艾滋病病毒可以编码硒蛋白，并利用氧化应激条件促进自身复制。近期研究显示，地域硒水平与新冠病毒感染患者的治愈率或死亡率可能相关[55]。国内外相关专家提出，应为新冠病毒感染患者提供足量的硒补充剂，如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、SelP等，以提高抗病毒能力[56]。

2.4 抗炎活性

Se具有抗炎特性，但其生物利用度和毒性是相当大的限制因素。研究者寄希望于富硒生物活性肽以弥补这种缺陷。富硒肽可抑制活性氧积累、增强环氧合酶和脂氧合酶的表达，从而减少致炎物产生[57]，目前发现有抗炎作用的富硒生物活性肽或富硒蛋白主要有GPX、硒蛋白S(SelS)、硒蛋白K(SelK)、SelP等。据报道，GPX可抑制炎症细胞因子和减少炎症部位自由基的过度产生[58]。GPX-1与GPX-2是上皮细胞LM分布的重要调节因子，对炎症的影响归因于核因子κB(NF-κB)通路的激活和环氧化酶2(COX-2)的下游调节[59]。对患有多囊卵巢综合征(PCOS)的妇女进行3个月的饮食干预，干预前后分别测定谷胱甘肽过氧化物酶(GPx3)活性、血浆铁还原能力和尿酸浓度，结果显示，增加GPx3在PCOS患者中的活性可减轻炎症反应[60]。SelS通过阻断脂多糖(LPS)诱导的NF-κB信号通路，抑制促炎因子TNF-α和白细胞介素-6(IL-6)的产生，最终对血管平滑肌细胞(VSMCs)的成骨钙化产生影响。此外，SelS还参与ERAD途径以减轻LPS激活的ER应激[61]。Gao等[62]从基因角度出发，证明SelK基因沉默可诱发炎症反应，具体表现在影响炎症因子(包括NFO-κB、COX-2和PTGE等)、炎症相关细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-7、IL-17)和热休克蛋白(HSP)的mRNA表达。SelP是一种胞外糖蛋白，序列中有3个N-糖基化位点和一个O-糖基化位点，是硒蛋白家族中唯一含有多个硒半胱氨酸残基的硒蛋白，其发挥抗炎作用表现在控制细胞氧化还原平衡、调节促炎因子、转录因子等方面[63]。

3 富硒生物活性肽的生物利用度评价

生物利用度是营养成分被生物体特定部位吸收并利用的比例和速度，即吸收比率(量)和吸收速率(速度)，是研究评价药品质量的重要标准，也是目前生物医学研究中必要考虑因素。生物利用度的评价方法包括测定血浆硒浓度的变化、GPX酶活性，以及吸收、保留研究。也有学者利用胃肠道(GI)上皮细胞水平上吸收富硒食品量作为指标来确定生物利用度[64]。为更好探究富硒生物活性肽在生物体内代谢吸收机制，体内外动物模拟实验被学者们广泛应用。

3.1 用于生物利用度研究的动物模型

Yoshida等[65]研究尼泊什(Niboshi)模型发现，提取的大鼠背神经节细胞和人宫颈癌细胞与硒共同孵育的硒依赖型GPX活性超过无提取物对照细胞的2倍，与相同硒浓度的硒酸孵育的细胞相当，表明Niboshi提取物中的硒被用于合成硒蛋白。田俊梅等[66]利用硒强化剂模型，在营养剂量范围内比较低硒大鼠对亚硒酸钠和硒蛋白的生物利用效果以及剂量-反应关系，结果证实硒蛋白相对亚硒酸钠能更好地被大鼠吸收利用。最近，小鼠和恒河猴模型显示脂多糖肽类抗生素(Dalbavancin)对严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的病毒复制和组织病理学损伤均有明显的抑制作用，表明Dalbavancin是具有应用前景的抗新冠病毒(COVID-19)候选药物[67]。动物模型在探究疾病机制中发挥极大作用，但由于缺乏标准化方法评估动物模型模拟人类疾病潜在生物学的针对性，使预测临床治疗策略有效性的价值仍然存在争议。为应对这种局面，Veening-Griffioen等[68]综合提出以下对策：标准化方法，如疾病模型识别框架(FIMD)；提高动物研究质量；提高科学目的动物研究的透明度。Schüttler等[69]指出，计算机模型可能比动物模型更能代表人类心房颤动(AF)，意味着无限的实验复制成为可能，且不用考虑成本和伦理因素，这或许是一条新的出路。

3.2 促进硒肽生物利用度的研究

富硒生物活性肽生物利用度取决于硒补充剂的来源和化学形式。鳟鱼对硒的保留量明显高于酵母菌或硒酸盐菌，这是因为在这类鱼中存在的硒是有机形式的，且烹饪或腌制鱼类不会影响硒的吸收或补充[70]。近些年，富硒酵母在商业中投入应用，它可能是硒组织积累的有效来源，对富硒的动物产品生产有明显的影响[71]。此外，生物利用度的测量必须考虑代谢转变，因为某些形式的硒即使被很好地吸收，但不能转化为生物活性代谢物，也就无法在生物利用度上得以展现。Fairweather-Tait等[72]指出，需要进一步研究稳定的同位素标签来阐明不同形式硒的吸收机制，同时还应排除其他微量元素的协同效果。

4 结论与展望

富硒生物活性肽是有机硒最佳载体，具有多种生物活性，且生物利用度较好。近年来，国内外学者对富硒生物活性肽的研究愈发深入，但对其作用机制研究尚少，且安全性评价存在一些问题。对富硒生物活性肽的来源、生理活性等方面加以介绍，旨在为今后富硒生物活性肽在生物、医药、保健等领域应用提供参考。随着近年来基因组学、生物信息学、蛋白质组学等学科的快速发展，今后对富硒生物活性肽的研究将在制备技术、生物活性作用机制、生物利用度评价、安全性评价等方面展开：(1)优化螯合方法制备富硒生物活性肽，提升硒螯合率；(2)肽与硒的结合方式及其他生物活性作用与安全性；(3)结合基因组学掌握重要富硒生物活性肽功能片段关键作用位点和机制，PCR技术实现精确合成；(4)结合生物信息学、生物标记等手段追溯富硒生物活性肽在机体代谢转运机制，寻求提高生物利用度、提高安全性途径，阐明功能肽在机体内的功效作用；(5)对富硒生物活性肽安全性制订标准化检测方法；(6)蛋白质组学技术将逐步从分子角度解释不同富硒生物活性肽之间的协同作用，探索更多形式的富硒生物活性肽，降低生产成本，拓宽在饮食中的应用范围。