九江市首例人感染猪链球菌病的病原学特征分析

熊火梅，罗菲，徐秋琴(九江市疾病预防控制中心微生物检验科，江西九江 333000)

猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis)可引起人感染猪链球菌病，是一种重要的人畜共患病病原菌，该病严重威胁人畜公共卫生安全。根据猪链球菌荚膜多糖抗原可分为35个血清型，其中猪链球菌血清2型是引起人感染的主要血清型，可引起人脑膜炎、败血病、心内膜炎、关节炎和其他严重并发症[1]。江西省于2006年报道1例人感染2型猪链菌病，于2014报道1例人感染1型猪链球菌病[2]，但均未见毒力和分子分型报道。本研究旨在对九江市发现的首例人感染猪链球菌进行病原学鉴定、毒力基因、药物敏感性分析和分子分型，为病原学诊断及疫情防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1研究对象 患者男，64岁，于2021年7月12日开始出现寒战、高热等症状，未就诊。后因病情加重于7月14日到九江市中医院就诊，入院时高热、意识障碍，脑膜刺激征阳性，采集脑脊液接种血琼脂平板置37 ℃、CO2培养箱培养15 h后，观察菌落特征，挑取单个可疑菌落革兰染色后镜检，BRUKER microflex质谱鉴定为猪链球菌。流行病学调查显示患者发病前买过3次猪肉，并洗过、切过猪肉，临床诊断为人感染猪链球菌病。经治疗于7月22日转出重症监护病房进入普通病房治疗，意识恢复后有听力受损。

1.2主要仪器与试剂 GEL Doc2000凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)，PCR仪(德国Senso公司)，引物由上海生工生物公司合成，10×PCR buffer、dNTPs及DL2000 DNA marker(大连TaKaRa公司)，2×Taq MasterMix及细菌DNA提取试剂盒(Bacteria Gene DNA Kit)(康为世纪公司)，E-test测试条(意大利Liofilchem公司)。

1.3DNA提取 挑取适量菌苔按Bacteria Gene DNA Kit试剂盒说明书提取DNA。

1.416S rRNA、血清型别及毒力基因鉴定 按照中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供的引物，用PCR法检测猪链球菌16S rRNA、血清2型猪链球菌特异性荚膜多糖编码基因片段cps2J、溶菌酶释放相关蛋白基因(muramidase-released protein,mrp)、溶血素基因(suilysin,sly)、猪链球菌的细胞外因子基因(extracellular factor,ef)。反应体系共20 μL，包括10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL、2×Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。扩增参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，51～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。退火温度及时间、引物及扩增片段大小见表1。扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。所有阳性对照均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。

表1 16S rRNA种、cps2J型及3种毒力基因引物序列、退火温度及目的片段

1.5药物敏感试验 对分离的菌株采用E-test条测试链霉素、壮观霉素、头孢克肟、庆大霉素、青霉素、利福平、万古霉素、复方磺胺甲噁唑、克林霉素、红霉素、四环素和阿奇霉素敏感性。药敏结果参考美国临床和实验室标准协会(CLSI)肺炎链球菌的标准进行判读，质控菌株为肺炎链球菌ATCC49619。

1.6多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST) 按照中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供的引物，对猪链球菌7个管家基因aroA、cpn、dpr、gki、recA、mutS、thrA进行PCR扩增。反应体系共20 μL，包括10 μmol/L上、下游引物各1 μL，模板1 μL、2×Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。dpr、mutS、recA扩增参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。aroA、gki扩增参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。cpn、thrA扩增参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物送北京天一辉远生物科技有限公司进行测序。测序结果导入数据库https://pubmlst.org/ssuis/进行比对，得到等位基因数值，查找对应ST值。

2 结果

2.1PCR鉴定结果 16S rRNA、cps2J和mrp、sly、ef3种毒力基因均为阳性，见图1、2。

注：M，DL2000 DNA marker；1，16S rRNA阳性对照；2，16S rRNA。

2.2MLST分型结果 7个管家基因电泳结果见图3。测序结果与MLST数据库等位基因信息比对，基因型为ST1型。

注：M，DL2000 DNA marker；1、3、5，分别为mrp、ef、sly阳性对照；2，mrp；4，ef；6，sly；7，血清1型；8，血清2型。

注：M，DL2000 DNA marker；1，aroA；2，cpn；3，dpr；4，gki；5，mutS；6，recA；7，thrA。

2.3药敏试验结果 E-test试验结果显示,对链霉素、壮观霉素、头孢克肟、庆大霉素、氯霉素、青霉素、利福平、万古霉素、复方磺胺甲噁唑和克林霉素均敏感，红霉素、四环素和阿奇霉素均耐药。

3 讨论

mrp、ef和sly是猪链球菌最常研究的经典毒力基因，研究表明mrp+ef+sly+基因型是2型猪链球菌典型的强毒株。为进一步了解九江市首例人感染猪链球菌的致病性，本研究分析得出mrp、ef、sly等毒力基因均为阳性，是2型猪链球菌强毒株型，与该病例入院时意识障碍、恢复意识后有听力受损等严重症状相符，也与贵州省报道的人感染猪链球菌毒力基因型相同[3]。洪家兵等[4]从猪分离到的62株猪链球菌中发现，70%以上的毒株含mrp，50%以上的毒株含ef，20%以上的毒株含sly，也证明了江西省猪链球菌毒力基因型具有多样性，提示本省mrp+/syl+/ef+毒株型从猪传染人的可能性。

研究表明，猪链球菌具有复杂的遗传多样性，并非所有血清2 型都显示相同的毒力水平，本研究MLST选择7个管家基因扩增，结果显示此次人感染猪链球菌血清2型为ST1型菌株，与江苏省报道的相同[5]，而国内最常见人感染猪链菌为1998年江苏省和2005年四川省爆发的ST7型[6]。ST1型与ST7型一样容易引起侵袭性病症，同属ST1克隆群，两者的差异仅在thrA基因上，ST1分离株被认为是含有最强毒的毒力基因，常常引起人间感染，可引起脑膜炎、休克等。Zhu等[7]对180 株猪链球菌血清2型分离株研究结果显示，ST1与ST7 为主的强毒群毒力基因型与本研究完全一致，为sly+epf+mrp+。

本研究采用E-test条测试对13种抗菌药物敏感性分析，结果显示该菌株对红霉素、四环素和阿奇霉素耐药，与四川省临床分离的28株2型猪链球菌药物敏感性检测结果相似[8]。阿奇霉素和红霉素均属于大环内酯类抗菌药物，有报道称从猪分离到猪链球菌大环内酯类药物的耐药率>70%，四环素类药物耐药>90%[9]。研究显示，江西省猪链菌球菌耐药性比较严重，主要以多重耐药为主[4]。其中对红霉素耐药率在80%以上，对四环菌耐药率在90%以上。从江西省猪分离到的猪链球菌和人感染猪链球菌耐药性分析结果提示应警惕人感染猪链球菌出现多重耐药性，提示临床治疗中需严格按照药物敏感分析结果科学用药。

志谢：感谢中国疾病预防控制中心传染病预防控制所郑潮主任、王建平老师、杜小莉老师给予的指导和帮助。