MALDI-TOF MS鉴定分枝杆菌的可靠性及潍坊地区分枝杆菌菌种分布*

程娟，严琨，韩守华，潘兆宝，李万生，王海志，刘光福(潍坊市第二人民医院 .检验科，.感染性疾病科，山东潍坊 261000)

分枝杆菌属包括结核分枝杆菌复合群、麻风分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌(non-tuberculosis mycobacteria，NTM)，截至2021年底报道的有效公布和正确名称的分枝杆菌子分类群数达194种(http://www.bacterio.net/mycobacterium.html)。NTM的细菌学特点与结核分枝杆菌类似[1]，故NTM感染易误诊为结核病。由于不同NTM菌种生物学特性、致病力、药物敏感性等方面均不尽相同，因此具有临床意义的NTM应该鉴定到种水平，以选择恰当的治疗方案[2]。

目前常用的分枝杆菌鉴定方法包括分子生物学检测、分枝菌酸分析、蛋白质谱图分析等[3]。分子生物学检测主要是以16S rRNA、RNA聚合酶β亚基(rpoB)、热休克蛋白65(hsp65)、16S-23S rRNA间区为主的直接测序技术和以探针杂交为基础的间接测序技术[4]。分枝菌酸分析则通过标准菌株的分枝菌酸指纹谱库比对进行菌种鉴定[3]。蛋白质谱图分析通过获取待测菌种特异的蛋白质谱图，与数据库比对进行菌种鉴定[3]。本研究利用多靶位测序技术评估基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技术鉴定分枝杆菌的准确度，同时将其应用于临床，得到分枝杆菌菌种分布情况，为分枝杆菌病防治提供依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 潍坊市第二人民医院接受治疗的患者，从痰、支气管肺泡灌洗液、胸水等各种临床标本中分离到的分枝杆菌，培养方法包括罗氏固体培养和BACTECTMMGITTM960液体培养，所有的菌株均经过萋-尼抗酸染色确认。2016年7月到2017年10月期间经MALDI-TOF MS(法国生物梅里埃公司，IVD V3.0)鉴定的751例菌株(鉴定置信度99.9%)同时进行rpoB、hsp65、16S rRNA的部分序列测序。2017年7月1日至2021年11月30日期间分离的6 350例分枝杆菌利用MALDI-TOF MS进行鉴定，分析分枝杆菌的菌种分布情况。

1.2主要仪器与试剂 PCR扩增仪(美国ABI公司)、Vitek MS V3.0及配套靶板、基质液(α-氰基-4-羟基肉桂酸，CHCA)(法国生物梅里埃公司)、3730XL测序仪(ABI公司)；罗氏固体培养基(珠海贝索公司)，BACTECTMMGITTM960液体培养基(美国BD公司)，PCR引物由上海生工生物公司合成。

1.3分枝杆菌MALDI-TOF MS鉴定

1.3.1菌株灭活 固体培养菌株：用1 μL接种环在罗氏培养基上取2满环菌，加入到含0.5 mm玻璃珠和500 μL 70%乙醇的2 mL圆底微量离心管中。液体培养菌株：先涡旋震荡BACTECTMMGITTM960液体培养基5～10 s，取3 mL加入离心管3 000×g离心10 min。用500 μL 70%乙醇重悬沉淀物，将悬液转入含0.5 mm玻璃珠的2 mL圆底微量离心管中。涡旋震荡15 min，室温垂直放10 min灭活。

1.3.2样本前处理及上机鉴定 将全部液体转移至2 mL离心管中12 000×g离心2 min。弃上清液，加20 μL 70%甲酸，充分混匀沉淀。加20 μL乙腈，充分混匀。离心2 min后取1 μL上清液涂靶板。完全干燥后加1 μL CHCA基质液。干燥后行MALDI-TOF MS鉴定，鉴定置信度99.9%为鉴定成功，记录鉴定结果。

1.4分枝杆菌测序鉴定

1.4.1基因组DNA提取 将菌株收集在1.5 mL离心管中，加入500 μL TE缓冲液，涡旋震荡，13 000 r/min离心2 min，弃上清液，对菌株进行清洗。加入200 μL TE缓冲液，金属浴95 ℃加热30 min，13 000 r/min离心2 min，上清液即可作为PCR扩增模板。

1.4.2PCR扩增 选择分枝杆菌鉴定常用的16S rRNA、rpoB、hsp65分子标记，根据文献[5-7]合成PCR引物，见表1。PCR体系30 μL，包括2×Master Mix 15 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 11 μL。反应参数：95 ℃ 3 min;95 ℃ 1 min,退火1 min,72 ℃ 1 min,35个循环；72 ℃ 10 min。

表1 16S rRNA、rpoB、hsp65 PCR扩增引物

1.4.3PCR扩增产物测序 将PCR扩增产物送至北京擎科新业生物技术公司，在ABI 3730XL测序仪上进行Sanger法测序，测序结果用BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比对，根据序列与GenBank中已知靶序列的同源性(≥99%)得到菌种鉴定结果。当16S rRNA、rpoB、hsp653种基因序列比对结果不一致时，以相似度最高的菌种作为标本所属菌种。

2 结果

2.1MALDI-TOF MS鉴定与测序结果符合率 751例菌株进行16S rRNA、hsp65、rpoB扩增测序，3个基因测序结果基本一致，除了有2株16S rRNA测序将龟分枝杆菌鉴定为脓肿分枝杆菌，1株结核分枝杆菌复合群16S rRNA扩增失败、无鉴定结果。以rpoB、hsp65、16S rRNA测序结果为参考结果，MALDI-TOF MS鉴定与测序结果一致的有745例，符合率为99.20%(745/751)；不一致的有6例，其中NTM被MALDI-TOF MS鉴定为MTC 4例， MTC被MALDI-TOF MS鉴定为NTM 2例。MALDI-TOF MS对结核分枝杆菌复合群(MTC)鉴定的准确率为99.66%(595/597)，对NTM鉴定的准确率为97.40%(150/154)。见表2。

表2 MALDI-TOF MS与rpoB、hsp65、16S rRNA测序结果比较

2.2分枝杆菌的菌种分布情况 MALDI-TOF MS鉴定本院分枝杆菌6 350株，共涉及13个分枝杆菌种类，见表3。近5年间分离的分枝杆菌中NTM 985株(占15.51%)，NTM种类主要为缓慢生长型(90.46%)，其中胞内分枝杆菌占比最高(73.20%)，其次为堪萨斯分枝杆菌(12.08%)；快生长型分枝杆菌以脓肿分枝杆菌为主(6.19%)。见图1。

表3 近5年本院MALDI-TOF MS鉴定分枝杆菌情况

图1 近5年本院各类非结核分枝杆菌占比

3 讨论

MALDI-TOF MS作为临床微生物实验室日渐广泛应用的一项新技术，许多研究者一直致力于扩大其微生物鉴定范围的研究。结核分枝杆菌的培养及质谱鉴定具有较高的生物安全要求，必须在加强型生物安全二级实验室开展，同时需要通过强化防护意识、提高个人防护措施、规范防护行为等方式减少生物安全风险[8]。结核分枝杆菌培养大多在结核病定点医院或部分研究机构开展，这些机构MALDI-TOF MS的普及率较低。

近年来随着研究的不断深入，MALDI-TOF MS对于分枝杆菌的鉴定逐渐从研究层面转变到临床应用。本研究选择分枝杆菌鉴定常用的靶基因rpoB、hsp65、16S rRNA测序对MALDI-TOF MS鉴定的分枝杆菌进行验证，旨在评估MALDI-TOF MS对分枝杆菌鉴定的准确度，为质谱鉴定分枝杆菌的临床应用提供理论依据。

16S rRNA测序是微生物鉴定领域常用的手段。然而，单独使用16S rRNA无法区分近缘的快生长型分枝杆菌，如龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌，产黏液分枝杆菌和富西亚分枝杆菌，需要rpoB、hsp65的辅助方可区分[9]。本研究使用的MALDI-TOF MS仪(生物梅里埃公司)可鉴定分枝杆菌的2个群水平，包括结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、卡氏分枝杆菌)、偶发分枝杆菌群(河床分枝杆菌、鼻疽分枝杆菌、偶发分枝杆菌、偶发分枝杆菌偶发亚种、休斯顿分枝杆菌、外来分枝杆菌、猪分枝杆菌、塞内加尔分枝杆菌)以及37个种水平。对于近缘物种，如鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌等均可区分。

结果显示，MALDI-TOF MS(生物梅里埃公司)对结核分枝杆菌复合群鉴定的准确率为99.66%，对NTM鉴定的准确率为97.40%。本研究质谱与测序结果不一致的有6例，其原因可能是：(1)培养的菌株不纯，得到混合细菌质谱图，出现错误结果；(2)蛋白质抽提质量影响质谱图质量，谱图质量较差会得到错误鉴定结果[10]；(3)被鉴定的菌株若为数据库未覆盖的物种，则无法得到准确的鉴定结果[10]，如测序结果为马赛分枝杆菌和血液分枝杆菌的菌株，二者的图谱未在MALDI-TOF MS数据库(生物梅里埃公司，IVD V3.0)中，质谱鉴定结果为结核分枝杆菌复合群。

潍坊市第二人民医院为潍坊地区的结核病定点医院，自2016年质谱仪引进之后，逐渐探索质谱法鉴定分枝杆菌菌种的流程，2017年开始常规使用，因此本院的数据在一定程度上可以反映潍坊地区分枝杆菌的感染情况。自2017年至2019年，本院NTM的分离率呈逐年上升趋势，而2020年出现明显的下降，分析可能受新冠肺炎疫情的影响，该年度结核分枝杆菌、NTM分离率均下降，2021年随着疫情防控常态化而逐渐出现升高趋势。

研究发现，NTM 感染率和菌种分布均存在着明显的地域差异，且与气候环境相关[11]。通常情况下NTM感染南方多于北方、沿海高于内陆、气候温和地区高于寒冷地区[1]。本研究发现潍坊地区NTM分布以胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌为主，与山东省NTM分布情况基本一致[12]。

总之，MALDI-TOF MS在临床分枝杆菌鉴定方面具有极大的优势：准确率高，与测序的符合率为99.20%；与测序相比，鉴定速度快，1 h即可完成，而测序需要3 d左右；可以鉴别近缘物种等。同时MALDI-TOF MS也具有一定的局限性：不能鉴定未培养的细菌；对于数据库之外的细菌无法鉴定，数据库需要不断完善补充；对细菌的纯度要求较高，否则会出现错误结果。