双酚A诱发卵巢储备功能下降大鼠模型的制备及其中医证候属性

秦秀云，张蕾，郑敏，张建伟

1 日照市妇幼保健院中医科，山东日照 276800；2 山东中医药大学第一临床学院；3 日照市妇幼保健院妇科；4 山东中医药大学附属医院中西医结合生殖与遗传中心

卵巢储备功能下降（DOR）是指卵巢内存留的可募集的卵泡数量和（或）卵母细胞质量下降，临床表现以月经异常、不孕症和围绝经期类不适为主［1］。该病发病率逐年升高，且有低龄化发展趋势［2］，若不及早进行有效干预，可在1～5年发展为卵巢早衰［3］，是妇科领域研究的热点和难点之一。双酚A（BPA）是当前环境普遍存在的环境污染物［4］，现有研究证实其对卵巢功能有不利影响［5］。2018 年5 月—2021 年12月，本团队拟在此基础上构建一种新的DOR病证结合动物模型并分析其证候属性，以期为进一步挖掘中医药对抗环境污染、保护女性生育力提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 SPF 级雌性清洁SD 大鼠：3 月龄45 只，体质量245～270 g；6 月龄30 只，体质量290～310 g；均购自济南朋悦动物实验有限公司，动物许可证编号［SYXK（鲁）20170022］，未交配，饲养于山东中医药大学附属医院实验室动物中心，自由摄食、饮水。保持室温23～25 ℃，相对湿度50～60%。检疫间适应性喂养1 周。本实验经山东中医药大学附属医院动物伦理委员会审核通过，伦理批件号：AWE-2019-045。BPA（美国Sigma 公司），玉米油（北京索莱宝科技有限公司），ELISA 检测试剂盒（上海江莱生物科技有限司）。本实验所用中药配方颗粒均购自山东中医药大学附属医院药房。显微镜（日本，OLYMPUS），电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］，切片机、包埋机（武汉俊杰电子有限公司）。

1.2 DOR模型制备方法筛选

1.2.1 动物分组及DOR 模型制备 选择动情周期规律［6］的3 月龄和6 月龄清洁SD 大鼠各18 只，不同月龄分别按随机数字表法进行分组，分为3或6月龄BPA 低剂量组、3或6月龄BPA 中剂量组、3或6月龄BPA 高剂量组。每组各6 只。大鼠每3 日称重1 次。BPA低、中、高剂量组分别每日给予50、100、200 mg/kg的BPA 混悬液灌胃［7］。各组均每日灌胃1 次，参考文献［8］以大鼠动情周期紊乱、FSH 与LH 升高，原始卵泡减少，闭锁卵泡增加为造模成功；并选择观察指标变化最明显组所用的模型制备方法为最佳方法。

1.2.2 大鼠一般情况观察 观察大鼠被毛、自主活动、肛温、饮水量和大便性状。

1.2.3 动情周期紊乱评估 每日上午9：00 进行阴道涂片观察大鼠动情周期。操作者左手固定大鼠，充分暴露阴道口，右手将提前蘸有生理盐水的消毒棉签轻轻旋转插入大鼠阴道内约0.5 cm，旋转1~2周后取出；将带有阴道内容物的棉签在事先准备好的载玻片上涂一0.5 cm×0.5 cm 均匀薄层，涂片过程中注意同时转动棉棒2周以保证涂片与实际周期相符。正常性成熟大鼠动情间期、动情前期、动情期和动情后期交替规律出现，若动情周期延长7 d及以上，或无明显周期，持续处于动情间期，或动情期延长至3 d及以上，视为动情周期紊乱［9］。

1.2.4 血清促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、抗苗勒氏管激素（AMH）、抑制素-B（INHB）检测 3、6月龄大鼠确定动情周期紊乱即处死；造模成功的18只大鼠干预2周后同时处死。拟处死大鼠16时禁食水，次日上午9时10%水合氯醛麻醉后快速开腹，暴露腹主动脉，取腹主动脉血5 mL静置30 min，3 000 r/min离心10 min（离心半径10 cm），移取血清于1.5 mL EP管，冻存于-80 ℃冰箱，用ELISA法检测血清FSH、LH、E2、AMH、INHB。

1.2.5 卵巢组织形态观察及各级卵泡比例、卵巢指数测算 采血后，恢复脏器生理位置，找到“Y”型大鼠子宫，沿双侧输卵管向上找到卵巢，小心分离卵巢，快速用电子天平称取卵巢湿重并记录，置于无菌

1.5 mL EP 管，密封，做好标记保存于液氮中，转移至-80 ℃冰箱冻存送检。每只大鼠取双侧卵巢称重，取左侧卵巢组织进行石蜡切片和HE 染色，显微镜下观察卵巢组织形态和各级卵泡比例［10］。药物干预后计算卵巢指数，卵巢指数=双侧卵巢湿重／处死前大鼠体质量×100%。

1.3 以方测证方法 选择18 只最优DOR 模型大鼠按照随机数字表法分为对照组、右归丸组、养精种玉汤组，每组6 只。将治疗肾阳虚的右归丸颗粒配制成浓度为0.189 g/mL 混悬液，治疗肾阴虚的养精种玉汤颗粒配制成浓度为0.403 g/mL 混悬液。对照组、右归丸组、养精种玉汤组分别给予蒸馏水、右归丸组、养精种玉汤按1 mL/100 g体质量灌胃，连续2 周。所有大鼠每日称重后调整药量。动情周期变化、卵巢组织形态和卵巢指数、血清性激素、INHB、AMH水平和各级卵泡观察及方法同上。

1.4 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。符合正态分布计量资料用±s表示，多组比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DOR模型制备结果

2.1.1 各组一般情况 各BPA 干预组大鼠活动减少，喜蜷卧扎堆，被毛稀疏，无光泽，饮水量减少，大便稀。

2.1.2 各组动情周期紊乱时间比较 3 月龄BPA低、中、高剂量组动情周期紊乱时间分别为（41.8 ±12.5）、（15.0 ± 2.4）、（36.3 ± 10.4）d；6 月 龄BPA低、中、高剂量组动情周期紊乱时间分别为（39.3 ±9.9）、（34.5±11.4）、（36.6±12.6）d。与其他组比较，3月龄BPA中剂量组动情周期紊乱时间短（P均＜0.01）；6 月龄各组间动情周期紊乱时间比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.1.3 各组激素、INHB和AMH水平比较 各组激素、INHB和AMH水平比较差异无统计学意义（P均＞0.05），但3 月龄BPA 中剂量组AMH 水平最低。见表1。

表1 各组激素、INHB和AMH水平（±s）

表1 各组激素、INHB和AMH水平（±s）

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2.1.4 各组各级卵泡比例比较 各组各级卵泡比例比较差异无统计学意义（P均＞0.05），但3月龄中剂量组原始卵泡最少，闭锁卵泡最多。见表2。

表2 各组各级卵泡比例（%，±s）

表2 各组各级卵泡比例（%，±s）

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2.2 DOR模型以方测证结果

2.2.1 各组动情周期变化 模型组大鼠实验期间持续处于动情周期紊乱状态，养精种玉汤组大鼠有1只恢复规律动情周期，右归丸组有5只大鼠恢复规律动情周期。

2.2.2 各组卵巢组织形态和卵巢指数比较 模型组大鼠卵巢苍白，体积变小，质地硬，右归丸组大鼠卵巢颜色红润，体积变大，组织弹性好，表面有多个生长卵泡，养精种玉汤组大鼠卵巢颜色较模型组红润，表面生长卵泡少，组织弹性差（见图1）。模型组、右归丸组、养精种玉汤组卵巢指数分别为1.95 ±0.20、2.46±0.44、2.11±0.27。与模型组比较，右归丸组卵巢指数高（P＜0.05），养精种玉汤组无明显改善（P＞0.05）。

注：图A模型组；图B右归丸组；图C养精种玉汤组。

2.2.3 各组激素、INHB、AMH水平比较 与模型组比较，右归丸组FSH水平低，LH、INHB、AMH水平高（P均＜0.05）；养精种玉汤组激素、INHB、AMH水平与模型组比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。与养精种玉汤组比较，右归丸组LH、INHB、AMH水平高（P均＜0.05）。各组E2水平比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清激素、INHB、AMH水平比较（±s）

表3 各组大鼠血清激素、INHB、AMH水平比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与养精种玉汤组比较，▲P＜0.05。

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2.2.4 各组各级卵泡比例比较 见表4。

表4 各组各级卵泡比例比较（%，±s）

表4 各组各级卵泡比例比较（%，±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与养精种玉汤组比较，▲P＜0.05。

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3 讨论

DOR 可导致育龄妇女过早出现月经稀发、闭经并伴随不孕，降低辅助生殖技术的成功率，尽早干预会避免其继续发展成卵巢早衰［11］。临床实践表明，中医药治疗DOR 具有很好的临床疗效［12］，但探讨DOR 的病因病机和中医药作用机制需要动物模型的支持［13］。在传统中医理论的指导下，结合现代动物实验技术，研究符合中医理论的动物模型，才能用于阐明中医理论内涵，验证评价中医药疗效。病证结合模型研究中如何将患者的主观症状与动物表达相匹配仍是当前最大难题。病证结合动物模型应该与人的生理、病理过程接近，符合中医病因特点，刺激条件可控可量化，诱因无创或微创；可通过特定的实验室诊断、仪器诊断和病理诊断、客观化的证候指标评价对动物模型进行评价［14］。目前应用较普遍的DOR 动物模型是雷公藤多苷［15］、环磷酰胺［16］、顺铂［17］、去氧乙烯基环己烯（VCD）［18］等造模法，这些方法造模简便，成熟，稳定性好，可重复性强；但其局限性在于仅代表了临床中部分患者发病过程，还有部分患者并无基础疾病或其他明显病因而发生DOR，研究更为广泛代表本病发病过程的病证结合模型很有必要。临床研究发现，DOR 在IVF 人群中所占比例越来越高，且有年轻化趋势［19］。

DOR 模型大鼠以动情周期发生紊乱［8］，并以动情周期延长为主要表现［20］。本研究发现，不同月龄不同剂量BPA 干预均会导致大鼠DOR，3 月龄中剂量组的成模时间相对集中，离散程度小，在实验操作上可行性最高。3 月龄BPA 低、中、高剂量组间FSH、LH、E2、INHB 均无明显差异，但3 月龄中剂量组AMH 水平和原始卵泡最低，闭锁卵泡最多。另外，3 月龄SD 大鼠是目前最易获得的实验动物，各实验动物公司均可提供，无需定制，降低了实验成本，增加了实验可控性。因此选择3 月龄SD 大鼠以每天100 mg/kg剂量BPA混悬液灌胃制备DOR模型是科学可行的造模方法。

历代医家认为生育能力的下降与肾密切相关，肾阳乃一身阳气之本，肾阳虚衰，温煦功能下降，可见弓背、蜷缩、耐寒能力下降；肾阳不足，脾失温煦，则大便稀溏；肾主生殖，肾虚，肾中阴阳失调，冲任受损，月经失调而致不孕。本研究中模型组大鼠卵巢功能下降，伴有体质量下降，饮水量减少，大便稀溏，活动能力下降等表现，提示该动物模型证候特点偏肾阳虚型，为进一步明确该结论，本研究运用以药测证（反证）的方法进一步研究。尽管有一定的局限性，“以方测证”是当前中医证本质及证模型研究应用最广泛的方法［21］，在肾主生殖理论指导下，采用经典方剂进行验证并多层次、多指标相结合增加了研究的科学性［22］。本研究选择中医学经典的治疗肾阳虚的右归丸与治疗肾阴虚的养精种玉汤进行模型大鼠的中医证候属性评价。结果发现，模型大鼠经右归丸干预后体质量明显增加，饮水量增加，大便性状改善，活动能力提高，FSH 降低，INHB 和AMH 上升，卵巢指数增加，原始卵泡明显增加，闭锁卵泡明显减少，生育能力提高；而养精种玉汤组变化不明显。说明温阳补肾能明显改善DOR 大鼠卵巢功能，增加卵巢储备，减少卵泡闭锁，效果优于滋阴补肾法。以方测证结果表明该大鼠模型属于肾阳虚型。

与其他常用造模方法比较，本造模方法优势在于探讨了当前部分无基础疾病或明显诱因的DOR人群致病因素，该致病因素作用于动物表现的外观行为和生理病理改变与临床部分病例发病过程相似；结果可逆，通过中药干预，尤其是右归丸组大鼠DOR 症状体征明显改善，符合病证结合动物模型研究标准。