沉默lnc-SLC2A12-10∶1抑制人胃癌细胞系AGS增殖、迁移和侵袭

刘 磊，李世宝，张好良*

(1.徐州医科大学 生理学教研室，江苏 徐州 221004； 2.徐州医科大学附属医院 检验科，江苏 徐州 221002)

胃癌(gastric cancer)在中国恶性肿瘤中的发病率和病死率均居前列[1]，早期胃癌治疗后5年生存率可超过90%，甚至治愈[2]，但中国早期胃癌的诊治率低于10%。传统的肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA72-4敏感性和特异性均不高，因此，寻找其他非侵入性的生物标志物筛选胃癌是非常必要的。外泌体中包含大量的蛋白质和不同的RNA，它们可以调节受体细胞的行为，并作为疾病的循环生物标志物[3]。既往研究表明肿瘤源性外泌体中长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)含量较高[4]，不同lncRNA在肿瘤的进展中可发挥促癌或抑癌的作用[5-8]。

Lnc-SLC2A12-10∶1在基因芯片、胃癌细胞和胃癌患者血清中外泌体中均高表达，提示lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌进展中发挥促癌基因的作用[9]。为进一步研究lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌中的调控机制，本实验采取lnc-SLC2A12-10∶1基因干扰技术构建lnc-SLC2A12-10∶1沉默的胃癌AGS细胞，探讨lnc-SLC2A12-10∶1对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌细胞系AGS和人胚胎肾上皮细胞系HEK-293T(中国科学院细胞库)；DMEM培养基(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；CCK-8试剂盒和Polybrene(徐州维科曼得生物工程有限公司)；Transwell小室和Matrigel基质胶(Corning公司)；pLVX-shRNA2-Puro vector(湖南科爱医疗器械有限公司)；miRNA 引物第一链 cDNA 合成试剂盒和引物(上海生工生物工程技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的设计及制备：针对lnc-SLC2A12-10∶1的靶点，构建shRNA片段序列(表1，shRNA由上海生工生物工程技术有限公司合成)。Oligo片段两两配对，混匀后置于PCR仪中95 ℃, 5 min，室温静置20 min，形成双链Oligo片段，经酶切后连接于载体上构建pLVX-shRNA-Puro。

1.2.2 慢病毒包装：将HEK-293T细胞按2.5×106个/mL的浓度接种于10 cm培养皿中，过夜培养。细胞汇合度在70%～80%开始按操作手册包装病毒。6 h后，更换新鲜DMEM完全培养基。24 h后在荧光显微镜下观察报告基因(ZsGreen1)表达情况，判断感染效率。在48、72和96 h连续3次收集病毒原液。将收集的原液 2 000×g离心5 min，去除细胞碎片，上清经过0.45 μm滤膜过滤。

1.2.3 稳定转染多克隆AGS细胞的筛选：将胃癌AGS细胞按照1×105个/孔接种在6孔板中，第2天细胞汇合度在50%～70%可进行慢病毒感染。每孔加入50 μL慢病毒和1 μL Polybrene混匀，8 h后换成完全培养基。24 h后在倒置荧光显微镜下观察ZsGreen1的表达情况，判断感染效率。感染48 h后换成含0.5 μg/mL嘌呤霉素筛选培养基，继续培养，每日观察，根据细胞状态传代，待细胞感染率达 80% 时结束筛选。按照文献[9]进行RT-qPCR并观察干扰效率。

1.2.4 CCK-8法检测胃癌细胞增殖：96孔板每孔加100 μL细胞悬液，调整细胞浓度至3×104个/mL，置于培养箱培养，每组细胞设置5个复孔。分别在22、46 h更换培养基为CCK-8悬液(100 μL完全培养基+10 μL CCK-8液/孔)，置于培养箱作用2 h后，在酶标仪450 nm处检测各孔吸光度(A)值。

1.2.5 划痕实验检测胃癌细胞迁移：将细胞按1×106个/mL铺于6孔板中，待细胞贴壁并增殖满后，弃去培养基，用10 μL枪头进行划痕， PBS清洗3次， 去除划下的细胞，加入1% FBS血清浓度的DMEM培养基，继续培养。 0、24 和48 h分别于相同位置拍照并分析。

表1 Lnc-SLC2A12-10∶1 shRNA片段序列Table 1 Sequences of lnc-SLC2A12-10∶1 shRNA fragment

1.2.6 Transwell小室法检测胃癌细胞迁移：在24孔板中加入完全培养基，放入Transwell小室，小室内加入200 μL细胞悬液，调整细胞为2×105个/mL，培养48 h。取出Transwell小室，弃去孔中培养基，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3次，将小室翻转晾干；0.1%结晶紫染液染色20 min，用PBS清洗3次，用棉签轻轻擦掉上室残留细胞。倒置显微镜观察拍照，200倍镜下取孔的上、下、左、右、中5个视野计数细胞，并计算平均值。

1.2.7 Transwell小室法检测胃癌细胞侵袭：提前将Matrigel基质胶放在4 ℃过夜融化。将Transwell放入24孔板，将Matrigel基质胶与预冷的DMEM培养基按1∶5体积稀释，取100 μL稀释胶加入Transwell上室，然后于培养箱中静置3 h，使Matrigel胶凝固。向Transwell上室加入细胞悬液100 μL，下室加入800 μL完全培养基培养48 h。取出Transwell小室，弃去孔中培养基，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3次，将小室翻转晾干；0.1%结晶紫染液染色20 min，用PBS清洗3次，用棉签轻轻擦掉上室残留细胞。倒置显微镜观察拍照，200倍镜下取孔的上、下、左、右、中5个视野计数细胞，并计算平均值。

1.2.8 Lnc-SLC2A12-10∶1靶向微小RNA(micro RNA,miRNA)软件预测和荧光定量 PCR 验证:根据lnc-SLC2A12-10∶1序列，用生物信息预测软件(上海伯豪生物科技公司)预测可能的靶向miRNA。使用miRNA 第一链 cDNA 合成试剂盒，按试剂说明书操作，获得miRNA cDNA。再用表2引物序列进行RT-qPCR 验证，以U6为内参，铁蛋白重链1(ferritin heavy chain 1，FTH1)为lnc-SLC2A12-10∶1亲本基因，结果基于2-△△Ct法计算，所有实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Lnc-SLC2A12-10∶1干扰的胃癌AGS细胞株的建立和鉴定

转染48 h后观察绿色荧光ZsGreen1的表达情况，各组转染效率均在80%以上(图1)。shRNA1、shRNA2、shRNA3(short hairpin RNA)均能有效干扰lnc-SLC2A12-10∶1的表达，shRNA2敲减效果最为明显，因此选择shRNA2组进行下一步实验。

表2 预测miRNA和lnc-SLC2A12-10∶1亲本基因引物

2.2 敲低lnc-SLC2A12-10∶1对AGS细胞增殖的影响

48 和72 h时lnc-SLC2A12-10∶1 shRNA2组较AGS NC组A值明显降低(图2)(P<0.05)。

2.3 沉默lnc-SLC2A12-10∶1对AGS细胞迁移的影响

与对照组细胞比较，沉默lnc-SLC2A12-10∶1后，细胞划痕愈合减慢(图3)(P<0.05)，迁移到Transwell下室的细胞量明显减少(图4)(P<0.05)。

2.4 沉默lnc-SLC2A12-10∶1对AGS细胞侵袭的影响

与对照组相比，沉默lnc-SLC2A12-10∶1后AGS细胞的侵袭能力明显减低(图5)(P<0.05)。

2.5 Lnc-SLC2A12-10∶1靶向miRNA荧光定量 PCR 验证

根据软件预测，lnc-SLC2A12-10∶1可能的靶向miRNA是hsa-miR-105-5p、hsa-miR-150-3p、hsa-miR-449b-3p、hsa-miR-588、hsa-miR-1275和hsa-miR-4701-5p。沉默lnc-SLC2A12-10∶1后，lnc-SLC2A12-10∶1的亲本基因FTH1表达增加(P<0.05)，同时hsa-miR-105-5p和hsa-miR-150-3p的表达也明显增多(P<0.05)(图6)。

*P<0.05 compared with NC group, scale bar=100 μm图1 不同lnc-SLC2A12-10∶1 shRNA转染AGS细胞后的荧光效果及干扰效率

*P<0.05 compared with NC group图2 CCK-8法检测沉默lnc-SLC2A12-10∶1对AGS细胞增殖的影响Fig 2 Effect of lnc-SLC2A12-10∶1 silencing on proliferation of AGS cells detected by CCK-8

3 讨论

胃癌的形成涉及到原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及表观遗传学调控等。近年来，大量研究证实lncRNA在胃癌的发生发展以及介导治疗耐药性等方面中起到重要的作用。Lnc-CTSLP4可抑制胃癌细胞的迁移、侵袭和上皮间质化[10]；沉默lncRNA TRPM2-AS可抑制胃癌细胞的增殖、 转移和放射抵抗[11]等。因此，寻找诊断lncRNA标志物及研究其调控机制，为胃癌诊断和治疗提供新的靶点，将具有巨大的临床应用前景和社会效益。

*P<0.05 compared with NC group, scale bar=200 μm图3 划痕实验检测沉默lnc-SLC2A12-10∶1对AGS细胞迁移的影响Fig 3 Effect of lnc-SLC2A12-10∶1 silencing on AGS cell migration detected by wound healing

*P<0.05 compared with NC group, scale bar=200 μm图4 Transwell小室法检测沉默lnc-SLC2A12-10∶1对AGS细胞迁移的影响Fig 4 Effect of lnc-SLC2A12-10∶1 silencing on AGS cell migration detected by Transwell assay n=3)

*P<0.05 compared with NC group, scale bar=200 μm图5 Transwe小室法检测沉默lnc-SLC2A12-10∶1对AGS细胞侵袭的影响Fig 5 Effect of lnc-SLC2A12-10∶1 silencing on AGS cell invasion detected by Transwell assay n=3)

*P<0.05 compared with NC group图6 沉默lnc-SLC2A12-10∶1对预测miRNA和亲本基因的影响Fig 6 Effect of lnc-SLC2A12-10∶1 silencing on predicted miRNA and parental gene

Lnc-SLC2A12-10∶1是新发现的lncRNA，位于6号染色体，含有1个外显子，是lncRNA，全长701 bp。前期研究发现lnc-SLC2A12-10∶1高表达与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移、分化程度有关[9]，但lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌中的功能未见报道。本课题组通过设计lnc-SLC2A12-10∶1干扰序列构建沉默细胞株，进行细胞功能实验，结果显示，敲减lnc-SLC2A12-10∶1之后，AGS细胞增殖、侵袭和迁移能力都受到抑制，表明lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌细胞中发挥促癌的作用。

LncRNA发挥功能，通常是通过序列特异性和构象结合与DNA、RNA和蛋白质相互作用，发挥支架、诱饵(分子壑或miR吸附)和RNA增强作用[12-13]。检索ensembl数据库发现，lnc-SLC2A12-10∶1属于假基因(pseudogene)铁蛋白重链1假基因26(ferritin heavy chain 1 pseudogene 26，FTH1P26)。假基因转录本最近被证明可以发挥竞争内源性RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)作用吸附miRNA，从而调控亲本基因的表达[14]。通过生物信息预测软件预测，发现lnc-SLC2A12-10∶1可能的靶向miRNA是hsa-miR-105-5p、hsa-miR-150-3p、hsa-miR-449b-3p、hsa-miR-588、hsa-miR-1275和hsa-miR-4701-5p。沉默lnc-SLC2A12- 10∶1后，lnc-SLC2A12-10∶1的亲本基因FTH1表达恢复，同时hsa-miR-105-5p和hsa-miR-150-3p表达也明显增加，提示hsa-miR-105-5p和hsa-miR-150-3p可能是lnc-SLC2A12-10∶1的靶向miRNA，并参与lnc-SLC2A12-10∶1对亲本基因FTH1的调控。

综上，本研究成功构建了lnc-SLC2A12-10∶1沉默的胃癌细胞株。实验初步证实lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌细胞中发挥促癌作用，若在肿瘤微环境中进行靶向敲除，理论上将会提高胃癌治疗效果。鉴于lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌细胞恶性生物学行为中的重要作用，其具体作用和机制仍需进一步研究。