难溶性香菇多糖无菌原料药细菌内毒素定量检测方法建立

丁苏苏，叶婵娟，姚晶晶，李倚云

（江苏省扬州市食品药品检验检测中心，江苏 扬州 225000）

香菇Lentinus edodes又称香蕈、冬菰，营养丰富，味道鲜美，被视为“菇中之王”，是我国久负盛名的珍贵食用菌，也是我国著名的药用菌，历代医药学家对香菇的药性及功效均有著述［1-2］。香菇多糖提取自香菇子实体，是香菇的主要有效成分，具有抗肿瘤、增强免疫功能、抗病毒、刺激干扰素形成等多种作用［3-4］。作为免疫辅助药物，香菇多糖可抑制肿瘤的发生、发展与转移，提高肿瘤对化疗药物的敏感性，改善患者的身体状况，并延长其生命，治疗胃癌、膀胱癌、肺癌、肝癌等的疗效良好［5-6］。本研究中参考2020 年版《中国药典（四部）》通则1143 细菌内毒素检查法［7］178-181，对香菇多糖无菌原料药中的细菌内毒素进行了动态浊度检查方法学［8］研究，同时考察了研磨法溶解样品的干扰性及回收率，为该产品采用动态浊度法进行细菌内毒素检查提供依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

VERSA max 型酶标仪（美谷分子仪器＜上海＞有限公司）；XS205DU 型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司，精度为0.01 mg）；ZH-2 型自动旋涡混合器（天津药典标准仪器厂）。研钵和试管均置金属容器中，于250 ℃烘箱中放置至少30 min，以去除可能存在的外源性内毒素。

1.2 试药

香菇多糖无菌原料药（南京某制药有限公司，批号分别为Y1904101，Y1904102，Y1905103，灰棕色颗粒）；细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院，批号为150601-201987，规格为每支80 EU）；细菌内毒素检查（BET）用水（批号为1909250，规格为每瓶50 mL），动态浊度法鲎试剂（批号为1912090，规格为每支1.25 mL，检测范围为10～0.01 EU/ mL），细菌内毒素检查反应板（批号为190603-078），均购自湛江安度斯生物有限公司；动态浊度法鲎试剂（福州新北生化工业有限公司，批号为19071812，规格为每支0.5 mL，检测范围为

10～0.01 EU/mL）。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值（L）确定

临床治疗时，注射用香菇多糖的使用剂量为1 周2 次，每次1 mg，用2 mL 灭菌注射用水振摇溶解，加250 mL 0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液，静脉滴注。按公式L=K/（f·M）计算，其中，L为供试品的细菌内毒素限值；K为人每千克体质量每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K为5 EU/（kg·h）；f为安全系数，由于本品为抗肿瘤辅助治疗药，为保证用药安全，根据指导原则，f取值为3［7］516-517；M为人用每千克体质量每小时的最大供试品剂量，人均体质量按60 kg 计算，则L为100 EU/mg。

2.2 供试品最大有效稀释倍数（MVD）确定

香菇多糖无菌原料药为分子量较大的多糖物质，未经过制剂工艺处理时，在水中极微溶解［5］。制备样品时，先在无热原研钵中将颗粒状香菇多糖无菌原料药轻轻压碎，研磨成细粉，加入适量BET 用水，继续研磨至香菇多糖溶散于其中，形成透明、均匀的溶液后，再用BET 用水稀释至质量浓度为0.2 mg / mL 的供试品溶液。按公式MVD =C·L/λ计算，其中，L为供试品的细菌内毒素限值，λ为标准曲线上最低的内毒素浓度，C为供试品溶液的浓度。本品L为100 EU/mg，λ为0.031 25 EU/mL，则MVD为640倍。

2.3 标准曲线建立与可靠性试验

取细菌内毒素工作标准品1 支，用BET 用水溶解，并稀释成终浓度分别为2.000 00，0.500 00，0.125 00，0.031 25 EU/mL 的系列标准曲线溶液，取上述溶液各0.1 mL，加至预先加有0.1 mL 鲎试剂的细菌内毒素检查反应板内，每个浓度平行3管。同时，以BET用水作阴性对照，平行2管。采用酶标仪测定，以细菌内毒素浓度对数值（lgC）为横坐标、平均反应时间对数值（lgT）为纵坐标绘制标准曲线，2批（安度斯，批号为1 912090；福州新北，批号为19071812）动态浊度法鲎试剂回归方程分别为lgT安=2.957-0.213 lgC安，r= -0.999 0；lgT福=2.939-0.205 lgC福，r= -0.996 0。结果阴性对照溶液反应时间均大于最低浓度标准曲线溶液反应时间，2 种鲎试剂所作标准曲线相关系数的绝对值均大于0.980，平行管之间变异系数均小于5%，表明细菌内毒素浓度在0.031 25～2.000 00 EU/mL 范围内，其对数值与平均反应时间对数值的线性关系良好，细菌内毒素的标准曲线均成立。结果见表1。

表1 细菌内毒素标准曲线的可靠性试验结果Tab.1 Reliability test results of the standard curves of bacterial endotoxin

2.4 干扰试验

取3批（批号分别为Y1904101，Y1904102，Y1905103）香菇多糖无菌原料药，各10 mg，精密称定，分别放入去除热原的研钵中，压碎，研细，加入BET 用水2 mL，继续研磨，直至香菇多糖溶散于BET 用水中，并呈透明、均匀溶液状，转移至试管中，用BET 用水稀释至质量浓度为0.2 mg/mL 的溶液，备用。再用BET 用水将上述溶液稀释至质量浓度分别为5.000 0，2.500 0，1.250 0，0.625 0，0.312 5 μg/mL 的系列供试品溶液A；选择靠近标准曲线中点的内毒素浓度（0.25 EU/mL）作为λm，制备与供试品溶液A 有相同稀释倍数且含细菌内毒素浓度为λm（0.25 EU/ mL）的供试品溶液B；另以2.3 项下标准曲线溶液作阳性对照，记作溶液C，每个浓度平行3管；以BET用水作阴性对照，记作溶液D，平行2管。分别取供试品溶液A、供试品溶液B 各0.1 mL，加至预先加有0.1 mL 鲎试剂的细菌内毒素检查反应板内，采用酶标仪测定，每个浓度重复2管。测定完成后，按标准曲线回归方程分别计算供试品溶液A、供试品溶液B 的细菌内毒素含量Ct和Cs，并按公式R=（Cs-Ct）/λm×100%计算回收率。结果见表2。当供试品溶液A 的质量浓度为5.000 0 μg/mL时，部分供试品溶液B的回收率大于200%；当质量浓度分别为2.500 0，1.250 0，0.625 0，0.312 5 μg / mL 时，供试品溶液B 的回收 率均在50%～200%范围内，均符合要求。故质量浓度选择2.500 0 μg/mL及以下进行样品定量测定。

表2 干扰试验结果Tab.2 Results of the interference test

2.5 研磨法处理样品细菌内毒素回收率试验［9-10］

样品为难溶于水的大分子物质，在供试品溶液制备过程中，进行了分次物理研磨处理，为验证研磨过程对细菌内毒素生物活性的影响，取细菌内毒素工作标准品1 支，加BET 用水溶解，按2.3 项下方法制备含细菌内毒素0.25 EU / mL 的溶液，备用，记为λm。分别取香菇多糖无菌原料药（批号为Y1904101）10.12，10.10 mg，精密称定，按2.4 项下方法分别制备溶液A、溶液B、溶液C、溶液D，采用酶标仪测定，并绘制标准曲线，分别得回归方程lgT安= 2.821 - 0.254 lgC安，r=- 0.999 6；lgT福= 2.883- 0.235 lgC福，r= - 0.999 0。计算样品中细菌内毒素含量，并计算研磨法细菌内毒素的回收率。由表3 可知，当供试品溶液的质量浓度为0.312 5～5.000 0 μg/ mL 时，细菌内毒素回收率均在50%～200%范围内；当质量浓度为2.500 0 μg/ mL 及以下时，细菌内毒素回收率均在80%～120%范围内，均符合要求。故质量浓度选择2.500 0 μg/mL进行样品定量测定。

表3 研磨法回收率试验结果Tab.3 Results of the recovery test by grinding method

2.6 样品中细菌内毒素含量测定结果

取3批（批号分别为Y1904101，Y1904102，Y1905103）香菇多糖无菌原料药各10 mg，精密称定，分别用BET用水稀释成质量浓度为2.500 0 μg/ mL 的供试品溶液。按2.3 项下方法制备标准曲线溶液和阴性对照溶液，标准曲线及相关系数为lgT= 2.911 - 0.203lgC，r= - 0.999 0。选择0.25 EU/ mL 作为λm，同时制备含上述供试品质量浓度及细菌内毒素浓度为λm的供试品阳性对照溶液，取上述溶液各0.1 mL，加至预先加有0.1 mL 鲎试剂的细菌内毒素检查反应板内，采用酶标仪测定，每批样品重复2管。结果见表4。

表4 样品中细菌内毒素含量测定结果（安度斯）Tab.4 Results of content determination of bacterial endotoxin in samples（Zhanjiang A&C Biological Co.，Ltd.）

3 讨论

细菌内毒素的检查方法包括凝胶法和光度测定法［7］178-181，其中凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行细菌内毒素限度检测的方法；光度测定法包括浊度法和显色基质法，浊度法是利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而定量测定内毒素含量的方法。相比于传统的凝胶法，动态浊度法具有操作方便、快捷、检测范围宽、灵敏度高等优点，当样品中含有一定量的内毒素时，动态浊度法可以通过回收率判定样品的干扰情况，方便试验者对假阳性结果作出判断［11］。

本研究中建立了定量检测香菇多糖无菌原料药中细菌内毒素的动态浊度法，当样品质量浓度为0.312 5～2.500 0 μg/mL 时，对试验无干扰作用，可选用质量浓度为2.500 0 μg/mL的供试品溶液进行定量测定。曾建立了检测香菇多糖无菌原料药中细菌内毒素的凝胶法［12］，与本检测结果一致。

香菇多糖属大分子化合物，难溶于水，可溶于热水或稀碱。用热水或稀碱处理样品，会对细菌内毒素的生物活性产生影响。温度低于70 ℃，内毒素分子的破坏程度与时间呈正比［13］；碱溶液对细菌内毒素也有一定破坏作用，且实际操作中，碱溶解样品后，需要用酸回调溶液的pH 值至合适范围内［14］，操作烦琐。本研究中采用物理研磨法增加了香菇多糖无菌原料药的溶解性，以提升样品的溶解速度，操作简便，且3 批香菇多糖无菌原料药的细菌内毒素回收率均接近100%，表明物理研磨法对细菌内毒素的生物活性无影响。

动态浊度法检测细菌内毒素在生产与临床上有良好的应用前景。反应曲线可直观显示反应过程，快速、准确测定样品中的内毒素含量，并考察样品受干扰情况，有利于在生产过程中实时监控无菌原料药的污染情况，降低生产风险［15］。由于单位时间内人体仅可承受一定限值的细菌内毒素，多种药物中细菌内毒素叠加，如超过限值，会导致危险［16］。而本品为癌症辅助治疗药物，与其他药物联用时，动态浊度法能准确、快速测定各药品中细菌内毒素的量值，可作为临床联合用药的参考。