张家口地区甲癣病原真菌分布及药物敏感性试验研究*

吴远慧，冯冬梅，王世宁，陈雷刚，杨晓静

（河北北方学院附属第一医院，河北 张家口 075000）

甲癣是临床较常见的皮肤科浅表真菌疾病，致病菌主要包括皮肤癣菌、酵母菌、霉菌等［1］，疾病进展缓慢，病程反复［2］。随着疾病的进展，可累及患者的甲板及甲下组织，给患者的生理、心理造成一定影响。有研究报道，甲癣地域性差异显著［3］。及时、有效分析甲癣病原真菌的分布及药物敏感性，对于指导临床用药具有显著意义。通常，温暖潮湿的环境适宜真菌生长［4］。但张家口地区的气候寒冷干燥，仅夏季为浅部真菌病高发季节，真菌性皮肤病的菌种分布可能与气候湿热地区有所不同，且国内一直缺乏张家口地区浅部真菌病病原菌检测及药物敏感性试验（简称药敏试验）分析相关的研究资料［5］。为此，本研究中分析了张家口地区甲癣病原真菌的培养鉴定及药敏试验结果，为临床治疗提供科学依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入标准：确诊为甲癣；符合浅部真菌病（手足癣、体癣、股癣、甲真菌病）的临床表现，实验性真菌镜检阳性。所有患者在张家口地区的分布性较均一。

排除标准：合并糖尿病、恶性肿瘤等慢性消耗性疾病；经过抗真菌治疗。

病例选择：采用描述性研究，选取我院2019年3月1日至2021年3月31日诊治的甲癣患者512例。其中，男255例，女257例；年龄10～66岁，平均（33.26±2.59）岁；体质量指数（24.55±2.65）kg/m2；病程（3.12±1.02）年；病灶部位的临床症状主要包括甲板内型、白色表浅型、全甲毁损型、近端甲下型、远端侧位甲下型等。

1.2 研究方法

甲癣病原真菌培养与鉴定：取患者的皮屑，分别进行直接镜检和真菌培养。直接镜检采取氢氧化钾玻片法，以查到菌丝结构为阳性结果。传统的真菌培养及鉴定方法为，取标本接种于含5×10-4g/L氯霉素的沙保弱琼脂培养基斜面，置25～27 ℃恒温培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）内培养，观察菌落生长情况，第4 周未生长者视为培养阴性。培养阳性者应用马铃薯琼脂培养基、玉米琼脂培养基、察氏培养基及尿素琼脂培养基行真菌分离培养与鉴定。根据菌落的大小、形态、生长速度、色素和质地，以及镜下菌丝、孢子的形态特征鉴定菌种。必要时做玻片小培养，结合镜下菌丝、孢子的形态和位置进行鉴定。在超净台上挑取和转种真菌，显微镜下观察，用棉蓝对挑取的菌落染色。记录菌种鉴定结果。

采用新兴的真菌核糖体DNA（rDNA）基因间隔序列（ITS）测定技术进一步确定致病真菌类型。1）真菌DNA 的提取：分别收集培养于沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上的真菌组织约100 mg，按照DNeasy Plant Mini Kit说明书提取菌株DNA，并利用E.Z.N.A.Micro Elute DNA CleanUp Kit 进行基因组DNA 纯化。所有操作按试剂盒说明书进行，测量其浓度及纯度。2）聚合酶链式反应- 高分辨熔解曲线分析技术（PCR - HRM）分型鉴定：于生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，得出菌种鉴定结果，并与传统的真菌培养与鉴定方法进行比较，判断结果是否一致。

药敏试验：采用抗真菌药物纸片（杭州微生物试剂有限公司，批号为20181223）进行药敏试验，选取张家口地区常用药物克霉唑、咪康唑、氟康唑、灰黄霉素、两性霉素、特比萘芬等。分别挑取菌落于1 mL 蒸馏水中，以获得菌丝和分生孢子的混合菌液，沉淀30 min；均匀涂布Mueller Hinton（MH）琼脂（英国Oxoid 公司，批号为20280930）平板；待平板干燥，将其置28 ℃温度下培养5～10 d。当平板生长时，测定抑菌环，得到药敏试验结果。分别对上述药物的耐药情况进行比较。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件分析。计数资料以率（%）表示，行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 真菌培养与鉴定结果

经过菌群培养与鉴定，共培养阳性菌群患者366例，检出病原菌366株，主要检出红色毛癣菌、犬小孢子菌、念珠菌及絮状表皮癣菌。详见表1。

表1 真菌培养与鉴定结果（n=366）Tab.1 Results of fungal culture and identification（n=366）

2.2 患者性别分布

犬小孢子菌、铁锈色小孢子菌以男性患者为主，青霉菌、念珠菌以女性患者为主。详见表2。

表2 真菌培养与鉴定结果患者性别分布（例）Tab.2 Results of fungal culture and identification of patients with different genders（case）

2.3 患者年龄分布

患者主要以31～40岁的感染人群为主。详见表3。

表3 真菌培养与鉴定结果患者年龄分布（例）Tab.3 Results of fungal culture and identification of patients with different ages（case）

2.4 阳性菌群患者药敏试验结果比较

药敏试验结果分析显示，阳性菌群患者对克霉唑及咪康唑的耐药率均在20%以上。详见表4。

表4 药敏试验结果（n=366）Tab.4 Results of drug susceptibility test（n=366）

3 讨论

流行病学调查显示，由甲真菌病造成的指甲疾病的发病率为15%～40%［6］。英国的甲真菌的发病率为3%，疾病的形成码显示，30%的患者多与足癣疾病显著相关［7］。老年人及男性患者的发病率显著高于其他人群［8］。同时，甲真菌病存在显著地域性及种族性差异［9］。英国一项调查显示，85%～90%的甲真菌病是由皮肤癣造成，而其他疾病则是由非皮肤癣菌疾病造成［10］。既往研究显示，造成甲真菌病的致病菌主要包括红色毛癣菌及须癣毛癣菌，而这类致病菌的感染多见于亲动物性的皮肤感染。而遗传学研究认为，甲真菌病的易感性具有显著遗传学基础，须癣毛癣菌及红色毛癣菌具有显著的家族遗传性［11］。传统的真菌鉴定方法为真菌培养后根据菌种的显微镜下形态进行鉴别，以其形态学、细胞学、生理学和生态学的特征为依据，简单、易行、直观，不需要昂贵的仪器，但在基层医疗机构仍未普及［12］，导致真菌性皮肤病的诊断主要是通过临床经验，常被误诊，且缺乏药敏试验，导致临床用药混乱，治愈率低。

本研究中，共培养阳性菌群患者366例，其阳性检出率在70%以上，与既往研究结果［13］一致。而在对阳性菌群患者的研究中，主要以红色毛癣菌、犬小孢子菌、念珠菌及絮状表皮癣菌为主，提示张家口地区的真菌感染主要以上述病原微生物为主。张蕊娜等［14］的研究显示，不管是老年人群，还是非老年人群，甲真菌病患者的主要致病菌均主要为红色毛癣菌。郑文爱等［15］对351株甲真菌病病原菌进行了体外药敏试验，结果红色毛癣菌和指（趾）间毛癣菌对特比萘芬的最低抑菌浓度几何均数最低。本研究中，张家口地区对两性霉素及特比萘芬的耐药情况显著降低，提示临床治疗首选两性霉素和特比萘芬，与郑文爱等［15］、杨虹霞［16］的研究结果较一致。不同性别、年龄患者的致病菌的感染情况呈显著差异，提示在治疗中应根据患者的年龄、性别调整治疗方式。

临床皮肤科门诊真菌性皮肤病病种多，病情复杂，并可能同时合并细菌或继发其他微生物感染，临床用药复杂多样，多有耐药现象，为治疗真菌性皮肤病带来了难度，易延误患者的治疗，导致病情反复不愈［17］。尤其是基层医疗机构缺乏真菌镜检、培养及鉴定技术，且传统的真菌鉴定方法在一定程度上受人为因素的干扰较大。本研究中，通过对患者的致病菌的核酸检测，并进一步核对致病微生物，提高了本研究结果的准确性［18］。

综上所述，张家口地区甲癣病原真菌以犬小孢子菌及红色毛癣菌为主，对两性霉素、特比萘芬的耐药性较低。临床需加强甲癣病原菌的检测与鉴别，选择治疗药物时可选择耐药性较低者，提高治疗效率。