一株产类胡萝卜素菌株的鉴定和培养条件优化及抗氧化特性分析

汪杰，孙向阳，姚红梅，张恕铭，李婵媛，郑淼心，张庆

（西华大学食品与生物工程学院,四川成都 610039）

类胡萝卜素作为有益的有机色素，天然存在于光合生物体内。同时，这些物质也常被发现存在于某些非光合生物中，它们主要起保护细胞免受光和氧气损坏的作用[1−2]。作为一种重要的脂溶性色素，类胡萝卜素除了其具有的颜色和采光特性外，还具有多种生物活性和化学特性[3]。它们常表现出强抗氧化能力、抗肿瘤和抗微生物特性，在食品、饲料、化妆品等领域被广泛应用[4−6]。目前类胡萝卜素的制备有化学合成法、植物提取法和微生物发酵法。其中，微生物发酵生产色素具有生产周期短、产量高、易进行基因工程改造、不受季节因素的影响等特点而成为目前的研究重点[3,7]。

产类胡萝卜素的微生物主要有霉菌、酵母、藻类和细菌等。Kaur等[8]以水果和蔬菜废料为发酵底物，对一株Blakeslea trispora(+)MTCC 884产β-胡萝卜素进行发酵条件优化，优化后的β-胡萝卜素产量为0.127 mg/mL。孔维宝等[9]对分离自土壤中的一株胶红酵母K-1产类胡萝卜素进行单因素和正交试验条件优化，优化后的类胡萝卜素产量达（180.14±2.45）μg/g (DCW)。Singh等[10]对一株香榧绿藻PUMCC5.1.1进行培养条件优化，在最优条件下，总类胡萝卜素可达118μg/g (DCW)。但目前能工业化生产类胡萝卜素的菌株还十分有限，而光合细菌、酵母、霉菌以及藻类又因其自身的种种限制而无法大规模生产[11]，因此从自然界中筛选获得优良类胡萝卜素产生菌仍具有相当大的研究价值。戈登氏菌作为革兰氏阳性菌的一种，在合成类胡萝卜素方面表现出不俗的能力。Sowani等[12]从碳氢化合物污染的热带土壤中分离获得一株Gordonia amicalisHS-11，该菌株除产表面活性剂外，还具有产类胡萝卜素的能力，其含量可达（2.9±0.10）mg/g (DCW)。Silva等[13]研究发现，G.alkanivorans1B具有产生叶黄素、角黄素以及虾青素的能力，其总类胡萝卜素含量可达2.015 mg/g (DCW)。Loh等[14]从台湾北部海水中分离得到一株Gordonia terraeTWRH01，通过优化培养基成分，得到15.29 g/L的菌体量以及10.58μmol/L的相对β-胡萝卜素浓度。

本研究以传统酿造郫县豆瓣为原料，分离、筛选鉴定产类胡萝卜素菌株，在单因素试验基础之上，通过Box-Behnken中心组合法对菌株产类胡萝卜素培养条件进行优化，并对菌株产类胡萝卜素进行抗氧化能力分析，旨在为微生物发酵制备类胡萝卜素提供菌种资源和理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

传统酿造的郫县豆瓣：成都市郫都区某郫县豆瓣公司。

1.1.2 培养基

基础培养基：酸水解酪素5 g/L，酵母膏10 g/L，细菌蛋白胨5 g/L，柠檬酸三钠3 g/L，氯化钾3 g/L，硫酸镁18 g/L，氯化钙0.2 g/L，硫酸亚铁0.001 g/L，氯化钠5 g/L，蒸馏水1000 mL，121°C灭菌20 min，固体培养基加2%琼脂粉。发酵培养基：蔗糖25 g/L，氯化钾5 g/L，氯化镁0.5 g/L，硫酸亚铁0.015 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，磷酸氢二钠3 g/L，柠檬酸钠2 g/L，蒸馏水1000 mL，121℃灭菌20 min，固体培养基加2%琼脂粉。

1.1.3 仪器与设备

台式高速大容量冷冻离心机（Multifuge XIR），赛默飞世尔科技（中国）；凝胶成像系统（Tanon3500R），广州誉维生物科技仪器有限公司；制冷恒温摇床（HNY-2102C），天津欧诺仪器仪表有限公司；双光束紫外可见分光光度计（UV2800PC），上海舜宇恒平科学仪器有限公司；超声波细胞粉碎机（Scientz-IID），宁波新芝生物科技有限公司；电子天平（JA2003），上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的筛选

取1.0 g郫县豆瓣于100 mL基础培养基中30℃光照培养5 d，将100μL菌液溶于900μL无菌生理盐水中以10倍稀释法依次稀释至10-7，涂布挑取产色素的单菌落。

1.2.2 菌株的鉴定

对筛选的菌株平板划线纯化并观察其菌落颜色形态。生理生化试验参考《伯杰细菌鉴定手册》[15]中的分析方法进行。提取纯化后的菌株DNA进行分子生物学鉴定，将测序结果提交至NCBI的GenBank数据库进行同源性比较，并选取相似度高的菌株构建菌株系统发育树。

1.2.3 类胡萝卜素的提取和定性

类胡萝卜素的超声破碎提取参照李超[16]的方法进行。

取少量色素三氯甲烷浸提液于干净的试管中，滴加1～2滴浓硫酸观察溶液颜色变化。若溶液变为蓝色或蓝绿色，证明可能存在类胡萝卜素[17]。采用紫外−可见吸收光谱（UV-Vis）将上述得到的色素粗提液在300～600 nm波长下进行全波长扫描，记录吸收光谱，并对该色素的特征吸收峰进行光谱分析[18−19]。

1.2.4 类胡萝卜素产量测定

参照孔维宝等[9]的计算公式对类胡萝卜素产量进行计算。

1.2.5 单因素试验设计

以丙酮为提取剂，选择培养时间、接种量、初始pH和装液量等参数进行单因素试验，考察其对类胡萝卜素产量的影响。各因素的梯度设置分别为：培养时间为24、48、72、96、120、144、168 h；接种比为1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%；初始pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；装液量为50、60、70、80、90、100、110 mL（250 mL锥形瓶）。

1.2.6 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，选取各因素的最佳值为响应面的中心点，利用Design-Expert 8.0.6软件，以类胡萝卜素产量为响应值，采用Box-Behnken中心组合设计试验，确定菌株产类胡萝卜素的最佳培养条件。因素和水平设计见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素和水平表

1.2.7 DPPH自由基清除能力测定

参考Liu等[20]的试验方法对DPPH自由基清除能力进行测定。

1.2.8 羟基自由基清除能力测定

参考侯靖等[21]的试验方法对羟基自由基清除能力进行测定。

1.2.9 超氧阴离子自由基清除能力测定

采用邻苯三酚自氧化法[22]对超氧阴离子自由基清除能力进行测定。

1.3 数据分析

每组试验重复3次，图形利用Origin 8.5软件绘制，利用IBM SPSS statistics 20软件对数据进行方差分析和多重比较。试验数据利用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 菌株分离纯化

从郫县豆瓣中筛选获得一株产色素菌株GH-1，该菌株在固体培养基中，30℃培养3 d，结果发现，菌落颜色为橘黄色，形状为圆形，不透明，凸起有褶皱（图1（a））。在显微镜下观察到菌株为长杆状，革兰氏染色为阳性（图1（b））。

图1 菌株GH-1的形态特征

2.2 菌株生理生化和分子生物学鉴定

菌株GH-1生理生化结果如表2所示。为明确菌株GH-1的分类学地位和系统发育关系，将菌株的16S rRNA序列利用BLAST检索分析，同源性比对，构建系统发育树，如图2所示，菌株GH-1被鉴定为暗红戈登氏菌（Gordonia rubripertincta）。

图2 基于菌株GH-116S rRNA序列构建的系统发育树

表2 菌株GH-1生理生化试验结果

2.3 菌株GH-1类胡萝卜素提取物定性

将菌株GH-1的类胡萝卜素甲醇提取液在300～600 nm全波长扫描，结果见图3。由图3可知，菌株类胡萝卜素提取液在479 nm波长处有最大吸收峰，符合类胡萝卜素在可见光的吸收范围，且其UV-Vis光谱具有类胡萝卜素紫外光谱典型的三指峰特点[23]。与Goswami等[24]在473 nm波长处得到的类胡萝卜素最大吸收峰比对，也初步证实菌株GH-1的色素产物为类胡萝卜素。同时浓硫酸显色反应表明，类胡萝卜素粗提液与浓硫酸的交接处有蓝绿色的光环出现，也为菌株GH-1产色素为类胡萝卜素提供了依据[25]。

1.2.5 椎动脉供血 采用彩色多普勒超声仪检测椎动脉的平均血流速度，由专人操作，仪器设定正常值标准参照。

图3 菌株GH-1的类胡萝卜素粗提液UV-Vis光谱

2.4 单因素试验结果

由图4（a）可知，随培养时间增加，菌株色素产量逐渐增加，当培养时间达到144 h时，色素产量最高，为（4.21±0.10）mg/L。随后色素产量下降，可能是因为随着营养消耗，菌体生长受到抑制，使色素合成受到影响[14]。因此，选择培养时间为144 h。

菌株GH-1色素产量受接种量影响如图4（b）所示。色素产量随接种量的增加而逐渐增加。色素产量在接种量为8%时最大，为（4.88±0.20）mg/L。继续增大接种量，色素产量开始减少，可能是因为接种量过大导致培养基溶氧不足从而影响菌体的生长以及产物的生成[26]。因此，选择接种量为8%。

培养基的初始pH值是影响菌体生长以及代谢产物产生的一个重要参数，它通过影响菌体内相关酶的反应以及细胞膜对营养物质的吸收从而产生影响[27]。由图4（c）可知，菌株GH-1在酸性环境下不适合生长，但随pH的升高，色素产量逐渐增加，当pH为7.0时，菌株GH-1的色素产量达到最大，为（5.47±0.20）mg/L。此后色素产量随着pH的升高而逐渐下降且趋于稳定。因此，选择初始pH为7.0。

装液量对菌株生长的影响表现在对其传氧系数以及氧溶解量的影响[28]。由图4（d）可知，最佳的装液量为60 mL，此时色素产量达到最大，为（6.39±0.10）mg/L。此后菌株色素产量随着装液量的增加而明显降低。

图4 培养时间、接种量、初始pH和装液量对菌株GH-1色素产量的影响

2.5 响应面试验结果

在单因素试验分析基础上，以培养时间144 h，接种量8%、pH 7.0和装液量60 mL/250 mL为响应面分析中心点，设计响应面优化试验，结果见表3。

表3 试验设计方案及响应值结果

采用Design Expert 8.0.6软件将表3所得试验数据进行回归分析，4个因素经回归拟合得到以色素产量为目标函数的二次回归方程：

表4 响应面方差分析

各因素交互作用响应曲面图如图5所示。图5（a）曲面最陡，说明培养时间和接种量的交互作用对色素产量的影响最为显著。对回归模型方程求导，得到最大色素预测值产量为7.25 mg/L，此时对应变量的最佳值为：培养时间145.49 h、接种量7.93%、pH 7.11和装液量59.78 mL/250 mL。

图5 发酵条件交互作用对色素生物合成量的影响响应面立体图

2.6 响应面模型的验证和优化

进一步对预测值进行验证，并将条件优化为：培养时间145 h、接种量8%、pH 7.0和装液量60 mL/250 mL。结果得出在此优化条件下色素产量为7.24 mg/L，与预测值（7.25 mg/L）基本一致，表明该响应面回归模型可靠。与未优化前相比，色素产量提高了1.95倍。

2.7 菌株GH-1产类胡萝卜素抗氧化能力测定

菌株GH-1产类胡萝卜素对3种常见自由基的清除能力如图6所示。由图6（a）可知表明，随色素质量浓度升高，菌株GH-1产类胡萝卜素对DPPH自由基的清除能力不断增强。当色素质量浓度达到200μg/mL时，其对DPPH自由基的清除率为67.00%，表明该色素具有良好的DPPH自由基清除能力。

羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力结果如图6（b）和图6（c）所示。在所有质量浓度下（40、80、120、160、200μg/mL），色素对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除作用均随着色素质量浓度的升高而逐渐增强。当色素质量浓度为200μg/mL时，羟基自由基的清除率最大为54.30%，与40μg/mL Vc的清除能力接近；超氧阴离子自由基的清除率为44.10%，表明该色素具有一定的羟基自由基和超氧阴离子自由基清除能力，综上显示该色素分子可作为一种潜在的抗氧化剂。

图6 菌株GH-1类胡萝卜素抗氧化活性评价

3 结论

从传统酿造郫县豆瓣中筛选、鉴定得到一株产类胡萝卜素的暗红戈登氏菌（Gordonia rubripertincta）GH-1。通过单因素试验和响应面分析法优化菌株GH-1产色素的条件，得到最佳的菌株产色素培养条件为培养时间145 h、接种量8%、pH 7.0和装液量60 mL/250 mL，在此优化条件下类胡萝卜素产量达7.24 mg/L。菌株GH-1产类胡萝卜素对DPPH、羟基自由基和超氧阴离子自由基有较强的清除能力，表明菌株GH-1产类胡萝卜素可作为潜在抗氧化剂。本研究表明，暗红戈登氏菌GH-1具有发酵高产优质类胡萝卜素的潜能，可作为优质功能性产色素微生物资源深入研究。