以糖蜜酸水解液为原料制备PHB的工艺优化

韩卓涛，陈育林，文小波，卢悦

（西华大学食品与生物工程学院,四川成都 610039）

全球每年大约生产3500万t塑料垃圾，其中大约只有7%经回收处理，剩余大部分被堆积于垃圾填埋场自然降解[1]。传统塑料降解缓慢，且在降解过程中会产生微塑料，不仅影响环境，更会危害人类健康[2]。这些问题推动了对可降解的、安全的传统塑料替代品的需求。聚羟基丁酸酯（Polyhydroxybutyrate,PHB）是最早发现的聚羟基脂肪酸酯，由于具有可生物降解性、可再生性、生物相容性和环境友好性等优点，可作为传统塑料的潜在替代品[3]。

PHB主要依赖于微生物发酵生产，可由许多细菌和古细菌在氮或磷受限时，作为碳源和能量物质被合成并积累于细胞内，由于较高的原料成本限制了其大规模生产和应用，因此目前PHB主要用于医学领域[4−5]。甘蔗糖蜜是制糖工业的主要副产物，含有丰富的多糖和还原糖，每生产1 t原糖便会有0.38 t糖蜜产出[6]。中国作为世界上最大的糖产区之一，糖蜜的年生产量可达400万t[7]。李曼玮[8]通过对甘蔗糖蜜的预处理，使其转化为易于利用的碳源，比如葡萄糖、果糖等，供微生物用于PHB的生产。除可发酵单糖外，乙酰丙酸（Levulinic acid,LA）也可用于培养杀虫贪铜菌（Cupriavidus necator,C.necator），并制备PHB[9−10]。作为具有较高应用价值绿色平台化合物的LA，可由多种废弃生物质经酸水解产生，是一种廉价、易得的发酵原料[11]。通常，含糖生物质为原料制备LA采用稀H2SO4和稀HCl的均相催化处理水解[12]。在此过程中，LA产率往往受多个条件因素的影响，对于多变量问题，采用响应面法可以简单准确地找出最优的一组水解条件因素[13]。

本试验以甘蔗糖蜜为原料，以H2SO4为催化剂，在单因素的基础上通过响应面法对LA的制备条件进行优化，以期获得更高的LA产率。同时利用甘蔗糖蜜水解液培养C.necator生产PHB，以期为后续研究提供一定的数据参考。

1 材料和方法

1.1 材料与培养基

1.1.1 试剂

市售糖蜜；LA，分析纯，上海皓鸿生物医药科技有限公司；浓硫酸、甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、5-羟甲基糠醛（5-Hydroxymethylfurfural,5-HMF）、糠醛、氯仿，分析纯，甲醇，色谱纯，成都科隆化学品有限公司；PHB，上海麦克林生化科技有限公司。

1.1.2 培养基

YPM液体培养基、矿物质溶液培养基按照Mohan等[1]试验方法进行配制，甘蔗糖蜜水解液培养基：在矿物质溶液培养基中添加甘蔗糖蜜水解液使培养基中LA初始浓度为5 g/L。甘蔗糖蜜水解液在响应面法获得的最佳条件下制得，经8000 r/min离心5 min去除杂质。上述培养基使用2 mol/L NaOH调节pH为7.0后121℃下灭菌20 min。

1.1.3 菌株

杀虫贪铜菌（CGMCC 1.7093），购于中国普通微生物菌种管理保藏中心。

1.2 试验方法

1.2.1 甘蔗糖蜜酸水解制备LA的单因素试验

选择液固比、反应温度和反应时间进行单因素试验，考察其对LA产率的影响。各因素的梯度设置：液固比为1、2、3、4、5 mL/g；反应温度为60、100、140、180、220℃；反应时间为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。

1.2.2 响应面优化试验设计

在单因素试验结果的基础上，利用Design-Expert 8.0.6软件，以LA产率（%）为响应值，采用Box-Behnken中心组合设计3因素3水平的响应面试验，确定甘蔗糖蜜酸水解制备LA的最佳条件。响应面因素水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素水平

1.2.3 甘蔗糖蜜酸水解处理

取一定量的甘蔗糖蜜和0.67 mol/L的H2SO4溶液[14]于反应釜中充分混匀，将反应釜放入强对流烘箱（Memmert UF260）中加热，在不同温度下反应到预定时间后迅速水冷至室温。将产物过滤获得水解液和残渣。水解液经稀释适当倍数后通过高效液相色谱法（HPLC，岛津LC16，配备SPD-16紫外可见双波长检测器）测定其中LA含量，并计算LA产率。

1.2.4 LA含量测定和产率计算

参考陈小敏等[15]的试验方法测定水解液中LA含量，LA产率（%）按照公式（1）来计算。

式中：ρ1为通过HPLC测得的LA浓度；N为稀释倍数；V为水解液体积；M为糖蜜质量。

1.2.5 水解液中小分子酸、5-HMF和糠醛含量测定

参照卢倩文等[16−17]的试验方法分别测定水解液中的甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、5-HMF和糠醛的含量。

1.2.6 甘蔗糖蜜水解液培养C.necator产PHB试验

在YPM固体培养基上挑取单个菌落接种于装有YPM液体培养基试管中，于30℃150 r/min培养24 h。8000 r/min离心5 min收集菌体，弃去发酵上清液，用0.85%的NaCl溶液复悬，按照5%接种量接种于糖蜜水解液培养基中，250 mL锥形瓶装样量100 mL，于30℃150 r/min培养48 h。通过干重法测得生物量。培养结束时收集菌体烘干后测定PHB含量。

1.2.7C.necator菌体中PHB含量测定

参照Lu等[18]试验方法进行菌体中PHB的提取和测定，按照公式（2）计算菌体中PHB含量（%）。

式中：m为测得的PHB质量；M2为菌体质量。

1.3 数据处理

每组试验重复3次，采用IBM SPSS statistics 20软件对试验数据进行方差分析和多重比较，采用Origin 2018软件进行绘图，采用Microsoft Excel 2019软件进行数据计算。

2 结果与分析

2.1 单因素对LA产率的影响

以蔗糖为主要成分的糖蜜酸水解制备LA一般需要经历3个过程[19]，如图1所示，在高温高压酸性条件下，蔗糖首先水解生成葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖进一步脱水形成5-HMF，5-HMF经水合反应最终形成LA和甲酸。在反应过程中，温度的升高和压力的增大会提高单糖生成5-HMF以及5-HMF生成LA的反应速率，但过高的温度会使单糖和5-HMF发生碎裂反应生成更多的副产物[20]。反应体系中原料的占比和水解时间也影响着反应的进程，因此以甘蔗糖蜜作为LA生产原料时，有必要研究液固比、反应温度和反应时间对LA产率的影响。

图1 蔗糖酸催化转化为LA的反应路线

液固比、反应温度和反应时间对LA产率影响如图2所示。由图2（a）可知，随着反应体系中糖蜜含量的降低，LA产率呈现先升高后下降的趋势，当液固比为2 mL/g时，LA产率最高，为34.05%。当反应体系中糖蜜含量较低时，H2SO4不能与糖蜜更好地接触，水解效率降低，但糖蜜含量过高时会破坏反应体系的均匀性，溶液呈粘稠状，水解过程中糖蜜易碳化从而使得LA产率下降[21]；因此，选择液固比为2 mL/g左右较为适宜。

反应温度对LA产率的影响如图2（b）所示，在140℃时LA产率最高，为36.45%。随着反应温度的提高，LA产率下降，在220℃降低至21.31%。氢离子电离速度会随着温度的升高而加快，从而提高水解速度，但高温会促使糖蜜生成更多的焦炭物质[19]，从而降低LA产率，同时高温也会加重H2SO4对容器的腐蚀程度[22−23]；因此，水解温度选择140℃左右为宜。

图2 液固比、反应温度和反应时间对LA产率的影响

反应时间对LA产率的影响如图2（c）所示，反应的前1.5 h内LA产率明显提高并在1.5 h达到最大，为39.77%。随着反应时间的进一步延长，LA产率下降并维持在一定水平，因此反应时间选择为1.5 h左右。

2.2 响应面优化试验的结果与验证

2.2.1 响应面试验结果的优化

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken响应面设计，以液固比（A）、反应温度（B）和反应时间（C）作为自变量，以液固比2 mL/g，反应温度140℃，反应时间1.5 h为响应面分析中心点，进行3因素3水平的响应面试验（表2）。17次试验表明，液固比越小、反应时间越短，LA产率越高，最高可达到46.27%，相反，高液固比和较长反应时间导致LA产率最高仅为24.91%。高温和低温对LA的产率均有负面影响，100℃下LA最高产率仅为25.15%，180℃下LA最高产率为35.03%。采用Design-Expert 8.0.6软件对表中试验数据进行多项式回归分析建立二次响应回归方程，拟合得到LA响应回归方程：

表2 甘蔗糖蜜酸水解制备LA Box-Behnken试验设计与结果

对模型进行显著性和方差分析，由表3可知回归方程决定系数R2=0.9026，R2Adj=0.7774，F值为7.21，回归模型P＜0.01，达到极显著水平，说明该方程显著回归，这意味着液固比、反应温度和反应时间的联合效应对LA产率的变化有显著影响。模型失拟项P>0.05，差异不显著，表明模型拟合程度良好且试验误差较小，可以用于分析和检测。各因素交互作用响应曲面图如图3所示。图3（a）表明，当温度为140℃时，LA产率达到最大，这意味着温度进一步提高到140℃以上时不会导致LA产率按比例增加。图3（b）曲面最陡，说明液固比和反应时间的交互作用对LA产率的影响最为显著。图3（b）和图3（c）相应曲线上没有显示出最大点和最小点，但该设计的范围已经可以为分析提供足够的有效信息，另一方面，不需要在更高液固比和更高反应时间下试验，因为LA产率极低。

图3 各因素相互作用对LA产率响应值的响应面图

表3 甘蔗糖蜜酸水解制备LA响应面设计回归模型方差分析

2.2.2 响应面模型的验证

根据以上优化结果，对模型预测值进行验证，根据实际情况将预测条件优化为：液固比1.24 mL/g、反应温度为146℃、反应时间为1 h，此条件下LA的产率为44.09%，与预测值（43.26%）接近，表明优化模型合理可靠。未优化时LA产率为17.39%，优化后LA产率大大提高。此外，本次优化后LA的产率优于宋道君等[21]报道使用硫酸催化甘蔗糖蜜制备LA的产率（30.11%）。

2.3 水解液成分的种类和含量

已有研究表明，过高浓度的小分子酸会对C.necator产生较强的生理毒性，抑制细胞生长，因此在发酵过程中应维持LA≤5 g/L、甲酸≤2 g/L、乙酸≤1 g/L、丙酸和丁酸≤0.5 g/L[9,24]。呋喃类化合物5-HMF和糠醛会导致C.necator的延滞期延长，但其在发酵液中浓度小于5 mmol/L时，C.necator可以通过自身的代谢机制对其进行有效脱毒[1]。对水解液中含有的几种小分子酸、5-HMF和糠醛含量进行测定，结果表明（表4），LA浓度可达196.20±3.32 g/L，甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸和5-HMF的浓度分别为46.23±4.16、37.84±3.47、24.86±2.06、2.02±0.06和25.11±0.57 g/L，糠醛的浓度较低，仅有0.43±0.06 g/L。水解液中LA等成分含量远远大于C.necator的耐受范围，进行批次发酵试验时，对水解液应进行适当稀释以降低其对C.necator的抑制作用。

表4 糖蜜水解液成分的种类和含量

2.4 糖蜜水解液培养C.necator

本研究通过富含LA的甘蔗糖蜜水解液培养C.necator验证其生产PHB的可行性。C.necator利用LA合成PHB的代谢网络见图4。LA以自由扩散的形式进入C.necator细胞后被酰基辅酶A合成酶激活生成丙酰辅酶A和乙酰辅酶A[25−26]，其中丙酰辅酶A可以通过2-甲基柠檬酸循环生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A可进入三羧酸循环用于细胞生长。两分子乙酰辅酶A在β-酮硫酶作用下缩合生成乙酰乙酰辅酶A，后者在NADPH依赖性乙酰乙酰辅酶A还原酶的作用下生成3-羟基丁酸酰基辅酶A，最后在PHA聚合酶的作用下缩合形成不断延长的聚合物骨架[25−28]。

图4 C.necator利用LA合成PHB的代谢网络

和其他小分子酸类似，LA可以酸化细菌的细胞质并抑制血红素合成从而影响细菌的新陈代谢，虽然可以通过逐步提高培养基中LA的浓度来增强C.necator对其耐受程度，但野生型C.necator只能在最高5 g/L LA下正常生长[9]。为了避免高浓度LA对C.necator产生强烈的抑制作用以及低浓度LA下碳源供应不足的情况，配制LA浓度为5 g/L的糖蜜水解液培养基培养C.necator进行PHB的生产试验。试验表明（图5），前12 hC.necator处于对LA的适应阶段，生长缓慢，可能5 g/L LA仍然会对其产生一定的生理毒性。随着LA浓度的降低以及生物量的缓慢增长，C.necator对LA的耐受能力提高并在12～36 h期间快速生长。36 h以后由于LA浓度较低，C.necator可利用的碳源不足，生长减缓。根据细胞质量计算公式C4.08H6.87N1.0O1.89可以推测氮约占C.necator细胞质量的14%[18]。本研究以2 g/L (NH4)2SO4作为细胞生长的唯一氮源，因此可以预测当氮源完全消耗后培养基中会形成约3 g/L生物量。培养48 h生物量达到2.99 g/L，与预测值接近，因此推测此时发酵液中仅残留少量未被利用的(NH4)2SO4。当碳源充足的培养基中存在氮时，C.necator主要进行菌体生长，在氮匮乏时C.necator才会在细胞内合成大量PHB[29−30]。经测定，培养48 h菌体中PHB含量占细胞干重的14.85%，发酵后期碳源的不足可能导致最终菌体中PHB含量较低，但通过本次试验足以说明富含LA的糖蜜水解液可以用于PHB的生产。

图5 糖蜜水解液中C.necator生长和LA消耗曲线

3 结论

本文以糖蜜为原料酸水解制备LA，通过单因素和响应面优化试验，获得最佳条件为液固比1.24 mL/g、反应温度146℃、反应时间1 h，水解液中LA的质量浓度为196.20±3.32 g/L，糖蜜转化为LA的产率为44.09%。水解液的其他成分质量浓度为：甲酸46.23±4.16 g/L、乙酸37.84±3.47 g/L、丙酸24.86±2.06 g/L、正丁酸2.02±0.06 g/L、5-HMF 25.11±0.57 g/L、糠醛0.43±0.06 g/L。以稀释后的糖蜜酸水解液为原料，培养C.necator48 h后，生物量达到2.99 g/L，菌体中PHB含量占细胞干重的14.85%。本文建立的二次多项式模型回归性显著且拟合程度良好，通过本次优化明显提高了糖蜜酸水解制备LA的产率，并验证了利用富含LA的糖蜜水解液用于生产PHB的可行性，为降低PHB生产成本提供了新的思路。