血清中miR-10b、LMP1和Twist1联合检测在鼻咽癌早期诊断及复发诊断中的应用

何 曦，李 钊，张建辉，郭 欣，杨怡静

(成都市第三人民医院，四川 成都 610031)

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)为常见恶性肿瘤，有独特流行病学特点，好发于中老年人，发病率位居耳鼻咽喉恶性肿瘤之首，与遗传因素、环境因素、病毒感染等有关，严重威胁患者生命健康[1-2].

放疗是治疗NPC患者的首选方法，可明显控制病情，研究[3]发现：NPC放疗后仍存在部分瘤灶残留或复发，复发诊断直接影响着下一步治疗方案和患者预后.NPC化疗后患者颈部将出现不同程度纤维化，CT或MRI影像学检查不利于患者早期诊治，目前生物学标志物在肿瘤诊疗中发挥重要作用[4].微小核糖核酸(micro RNA，miRNA)是一类数量多、功能杂的调控因子，miR-10b属于miRNA成员之一，在恶性肿瘤中常见[5].有研究[6]发现：miR-10b表达与其上游调节因子EB病毒编码潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP1)/人Twist相关蛋白1(Human twist related protein 1，Twist1)间存在密切关联性，发现NPC在恶性肿瘤中通过LMP1/Twist1调控miR-10b表达而参与疾病发生和发展.还有研究[7]发现：LMP1可促进B淋巴细胞永生化，恶性转化鼠成纤维细胞及人上皮细胞，影响鼻咽癌细胞增殖和凋亡.Twist1过高表达与乳腺癌、胃癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤发生密切相关[8].本研究通过探究血清中miR-10b、LMP1和Twist1联合检测在NPC早期诊断及复发诊断中的应用价值，旨在为NPC诊治和预后评估提供更多参考.

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月—2020年1月成都市第三人民医院收治的NPC患者113例(NPC组)、鼻咽炎45例患者(鼻咽炎组)为研究对象.其中，NPC组患者男61例，女52例，年龄32～60岁，平均(45.34±10.27)岁，临床分期：Ⅰ期54例、Ⅱ期59例；鼻咽炎组患者男25例，女20例，年龄31～61岁，平均(44.97±9.99)岁.两组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具备可比性.

纳入标准：经病理活检(病灶呈结节状、菜花状，局部粗糙隆起)明确诊断为NPC或鼻咽炎；抽取血液前未接受任何治疗；NPC患者无放疗禁忌证；鼻咽炎患者既往无鼻咽部肿瘤.

排除标准：合并其他类型肿瘤者；NPC患者KPS评分低于60分者；近期存在严重感染者；合并重要脏器功能障碍者；存在风湿免疫性疾病或血液系统疾病者；对放疗不耐受(放疗期间发生严重放疗并发症)者；生物制剂过敏者；合并严重精神疾病者.

1.2 研究方法

血清中miR-10b、LMP1和Twist1检测：采集入组患者治疗前晨起空腹外周血3 mL，放置于EP管内，室温下静置30 min，待自然凝固后常规离心(1 000 r/min，离心半径为9 cm)10 min后，收集血清(上清液)，置于-80 ℃冰箱内保存待测.应用快速mRNA反转录试剂盒将已纯化好的总mRNA进行反转录，并采用荧光定量PCR试剂盒在ABI 7500仪器上行qPCR反应，以检测血清中miR-10b、LMP1和Twist1相对表达量，实验重复3次，最后取平均值.并根据LMP1和Twist1相对表达水平将NPC患者分为Twist1阴性表达组、Twist1阴性而LMP1阳性表达组、Twist1、LMP1同时阳性表达组.

NPC患者治疗方法：患者均给予放疗，放疗前应用多西他赛+顺铂+5-氟尿嘧啶或紫杉醇+顺铂等方案化疗；对鼻咽部和颈部淋巴结进行放射线(调强适形放射治疗(IMRT))治疗，放疗剂量为50～70 Gy；采用西妥昔单抗或尼妥珠单抗进行靶向治疗.

NPC患者复发随访情况：疗程结束后随访18个月.复发判断[9]标准：NPC患者放疗后经影像学检查存在瘤灶残留，经细胞学穿刺学检查、手术切除后病理和临床+多种影像学检查明确诊断为瘤灶复发，并依据NPC患者有无复发分为复发组和无复发组.

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 NPC组、鼻咽炎组血清miR-10b、LMP1和Twist1表达

本研究结果显示：NPC组血清miR-10b、LMP1和Twist1相对表达量明显高于鼻咽炎组，差异具有统计学意义(P<0.05).见表1.

表1 NPC组、鼻咽炎组血清miR-10b、LMP1和Twist1表达Tab.1 Serum miR-10b，LMP1 and Twist1 expression in NPC group and nasopharyngitis group

2.2 miR-10b表达水平与Twist1、LMP1关系

本研究结果显示：Twist1阴性表达组、Twist1阴性及LMP1阳性表达组、Twist1、LMP1同时阳性表达组miR-10b表达水平依次明显增高(P<0.05).见表2.

表2 NPC患者miR-10b表达水平与Twist1、LMP1关系Tab.2 Relationship between miR-10b expression level and Twist1 and LMP1 in NPC patients

2.3 血清miR-10b、LMP1和Twist1预测NPC的ROC曲线分析

本研究结果显示：血清miR-10b、LMP1和Twist1三项联合(串联)检测预测NPC的价值较高(特异度、ROC曲线下面积分别为86.5%、0.860)，高于三者单独检测，而血清miR-10b预测NPC的ROC曲线下面积、特异度高于LMP1、Twist1.见图1、表3.

图1血清miR-10b、LMP1和Twist1预测NPC的ROC曲线Fig.1ROC curve of serum miR-10b，LMP1 and Twist1 predicting NPC

表3 血清miR-10b、LMP1和Twist1预测NPC的ROC曲线分析Tab.3 ROC curve analysis of serum miR-10b，LMP1 and Twist1 predicting NPC

2.4 NPC患者复发的单因素分析

本研究结果显示：NPC患者113例，复发19例，复发率为16.81%；复发组患者年龄≥30岁、分化程度为低分化、血清miR-10b、LMP1和Twist1相对表达量明显高于无复发组(P<0.05).见表4.

表4 影响NPC患者复发的单因素分析Tab.4 Single factor analysis of affecting recurrence in NPC patients

2.5 影响NPC患者复发的混杂因素Logistics回归分析

NPC患者是否复发为应变量(复发=1、无复发=0)，上述单因素分析中具有统计学意义的指标(年龄：≥30岁=1、<30岁=0；分化程度：低分化=1、高分化或中分化=0；血清miR-10b、LMP1和Twist1相对表达量以实际值为准)为自变量进行赋值，经Logistics回归方程分析并校正混杂因素(年龄、分化程度)后，提示血清miR-10b、LMP1和Twist1相对表达量是NPC患者复发的影响因素(P<0.05).见表5.

表5 影响NPC患者复发的混杂因素Logistics回归分析Tab.5 Logistics regression analysis of confounding factors affecting recurrence of NPC patients

2.6 血清miR-10b、LMP1和Twist1表达预测NPC复发的ROC曲线分析

本研究结果显示：血清miR-10b、LMP1和Twist1表达联合(串联)检测预测NPC患者复发的特异度(89.9%)和ROC曲线下面积(0.892)高于单一检测.见表6和图2.

表6 血清miR-10b、LMP1和Twist1表达预测NPC复发的ROC曲线分析Tab.6 ROC curve analysis of serum miR-10b，LMP1 and Twist1 expression in predicting NPC recurrence

图2血清miR-10b、LMP1和Twist1表达预测NPC复发的ROC曲线Fig.2ROC curve of serum miR-10b，LMP1 and Twist1 expression predicting NPC recurrence

3 讨 论

NPC是鼻咽黏膜的恶性肿瘤，有早期远处转移和局部侵袭特征，转移患者预后差且复发率高[10].MRI和CT等影像学技术尽管在恶性肿瘤辅助诊治中发挥重要作用，但对于早期NPC患者诊断的特异度和灵敏度并不高，目前大量研究[11]证实血清学标志物在恶性肿瘤早期预测中有积极作用.刘春丽等[12]报道NPC患者癌组织中miR-10b表达明显增高，且其表达水平与患者年龄、临床分期等紧密相关.孟大为等[13]研究发现，降低Twist1表达可增加NPC细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性，并推测Twist1蛋白可作为一项新的NPC治疗靶标.YE Q等[14]展开的LMP1和Cripto-1在鼻咽癌中共表达的体内外研究中证实，NPC组织中LMP1表达水平明显高于鼻咽炎的表达水平，其水平高低与NPC细胞增殖、转移等密切相关.现阶段关于miR-10b、LMP1和Twist1与NPC关系研究停留在动物、组织学层面，血清属于理想的介质，取材方便且创伤小，近年来随着芯片PCR技术日益完善，进一步明确血清中miR-10b、LMP1和Twist1表达在NPC患者早期诊断和复发诊断中的应用价值具备可行性和临床指导价值.

本研究结果显示，NPC组血清miR-10b、LMP1、Twist1相对表达量较鼻咽炎组高，不同于其他研究之处：本研究检测的为血清学标志物，提示NPC患者血清miR-10b、LMP1、Twist1表达异常增高，说明异常增高的血清miR-10b、LMP1和Twist1可能相互协同参与NPC疾病的发生和发展.李伟利等[15]在血清miR-20a等指标表达对早期NPC的诊断价值研究中，通过ROC曲线分析发现血清学标志物联合检测可准确、特异性地预测早期NPC.而本研究结果显示：血清miR-10b、LMP1和Twist1三项联合(临界值分别为2.31、1.92、1.87)检测诊断NPC的特异度、ROC曲线下面积分别为86.5%、0.860，高于三者单独检测，其中，血清miR-10b预测NPC的ROC曲线下面积、灵敏度高于LMP1、Twist1，提示血清miR-10b≥2.31、LMP1≥1.92和Twist1≥1.87时鼻咽部疾病患者可明确诊断为早期NPC，积极监测患者血清miR-10b、LMP1和Twist1表达水平可有效提高NPC的早期诊断率.复发是危害NPC患者生存的重要影响因素[16-17]，本研究纳入NPC患者临床分期以Ⅰ期、Ⅱ期为主，且随访时间短，NPC患者复发率为16.81%，但短期内复发率仍较高的原因考虑可能是本次应用化疗药物量低.因此，早期预测患者复发风险对及时有效治疗和降低死亡率、提高生命质量有积极意义.

本次研究结果显示，复发组患者年龄≥30岁、分化程度为低分化、血清miR-10b、LMP1和Twist1相对表达量较无复发组明显高，进一步校正混杂因素结果显示：血清miR-10b(OR=1.523，95%CI：1.216～1.909)、LMP1(OR=1.523，95%CI：1.029～2.142)和Twist1相对表达量(OR=1.523，95%CI：1.052～2.189)与NPC患者复发密切相关，提示血清中miR-10b、LMP1和Twist1表达可能参与NPC患者肿瘤侵袭和转移，增加患者复发风险.miR-10b在肿瘤细胞生长发育和分化调控及凋亡中起着重要作用，有研究[18-19]证实miR-10b参与肿瘤侵袭和转移、调高miR-10b水平，可通过特异性调节多种靶基因对肿瘤细胞的生物学行为产生影响，也佐证了miR-10b是NPC患者复发的高危因素.HUO H等[20]研究表明，CRISPR/Cas9介导的LMP1基因敲除可明显抑制Eb病毒感染及NPC细胞生长，由此推测血清LMP1表达水平与NPC患者复发有关.Twist1可诱导上皮细胞/间充质转化，在胚胎发育期可影响细胞迁移[21-23].有研究[24-25]指出，Twist1在多类癌细胞内高表达，Twist1过表达可明显抑制细胞凋亡，因此，推测血清Twist1表达参与NPC患者的复发.此外，本研究结果显示：血清miR-10b、LMP1和Twist1表达联合(串联)检测预测NPC患者复发的特异度(89.9%)、ROC曲线下面积(0.892)较三者单一检测的要高，提示血清miR-10b、LMP1和Twist1联合检测可特异性的预测NPC患者复发风险.因此，临床上通过加强NPC患者血清miR-10b、LMP1和Twist1的监测是十分必要的，对早期防治具有重要指导意义.

综上所述，本研究初步证实血清中miR-10b、LMP1和Twist1联合检测在NPC早期诊断及复发诊断中有明确应用价值，对指导NPC患者早期防治和改善预后具有积极临床意义.但本研究尚未明确三者参与NPC复发的具体分子信号通路，未来还需进一步研究完善.